楊文智，趙亞非，吳桐，劉嬌艷，李海鷹

(河北大學 藥學院，河北 保定 071002)

微球制劑作為緩控釋給藥新劑型之一，具有緩釋藥物、提高藥物穩(wěn)定性、保證療效、減少給藥頻次和降低毒副反應(yīng)等優(yōu)點，受到藥物研究者的青睞[1-2]，常見的載藥微球可選擇天然高分子、合成與半合成的高分子為載體，如：明膠、殼聚糖、淀粉、白蛋白、葡聚糖、海藻酸和透明質(zhì)酸(HA)等天然高分子；聚乳酸、丙交酯乙交酯共聚物、聚3-羥基丁酸等聚酯類、聚丙烯酸樹脂、聚酰胺、聚乙烯醇、乙基纖維素、纖維醋法酯等合成與半合成高分子材料. 普魯蘭多糖(Pu)由α-1,6糖苷鍵連接的麥芽三糖單元組成，出芽短梗霉分泌，可被淀粉酶降解，具有水溶性、無毒、無致突變作用、無免疫原性、無致畸作用、良好生物相溶性及可生物降解等優(yōu)良特性，常用作藥物載體的材料[3-6]. 為了拓展Pu在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，化學修飾Pu成為研究熱點[7-8]. HA同樣具有良好的生物相溶性、文獻報道HA微球可靶向富含CD44受體的腸癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤細胞，故被廣泛用于緩控釋藥物的載體[9-11]. 如：與游離阿霉素(DOX)相比，負載DOX的透明質(zhì)酸-聚γ-芐基-L-谷氨酸胃蛋白體可靶向MCF-7腫瘤細胞，對乳腺癌有更好抑制作用[12]；采用HA包載拉帕替尼納米晶，可抑制腫瘤生長，提高動物存活率[13]. 但單獨使用HA作為藥物微球載體，需克服其體內(nèi)迅速降解的缺點[14-16]. 本課題組將HA接枝到Pu糖長鏈上，制備透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖(HA-Pu)材料，該新型材料具有較好的生物安全性和抗酶降解性能，可減緩其在體內(nèi)降解速度[17].本文擬采用抗酶降解的HA-Pu為微球載體材料，經(jīng)化學交聯(lián)制備負載抗腫瘤藥物阿霉素的HA-Pu微球(DOX-HA-Pu MPs)，希望獲得具備體內(nèi)緩釋抗瘤的載藥微球制劑.

1 實驗部分

1.1 儀器、試藥與實驗動物

LGJ-18冷凍干燥機(寧波新芝儀器有限公司)；DVM 6光學顯微鏡(德國徠卡公司)；FTIR-8400s傅里葉變換紅外分光光度計(日本島津儀器公司)；T6型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；LC 3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司).

透明質(zhì)酸(5400 Da，山東福瑞達醫(yī)藥公司)；普魯蘭糖(2000 KDa，日本林原化學株式會社)；阿霉素(大連美侖生物技術(shù)有限公司提供)；透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖(HA-Pu)材料源于實驗室自制[17]；其余試劑均是分析純.

雄性Wistar大鼠(150～200 g)，由河北省實驗動物中心提供(合格證號：1507012).

1.2 實驗方法

1.2.1 HA-Pu微球或載藥微球(DOX-HA-Pu MPs)的制備、優(yōu)化及表征

稱取HA-Pu適量，加入蒸餾水攪拌溶解，如：制備載藥微球，將DOX加入HA-Pu獲得藥物與載體材料的水溶液. 將液體石蠟及適量Span 80充分攪拌混勻后，在其中緩慢滴入HA-Pu或載藥載體材料水溶液，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，乳化30 min，滴加適量戊二醛液，室溫反應(yīng)1 h，加入異丙醇，攪拌10 min，靜置，過濾，乙醚洗滌，干燥，即得HA-Pu MPs或DOX-HA-Pu MPs.

采用BBD實驗設(shè)計方法優(yōu)化HA-Pu MPs處方，考察影響微球平均粒徑的轉(zhuǎn)速(X1，r/min)、油水比(X2,體積比)和HA-Pu溶液質(zhì)量濃度(X3mg/mL)3個因素，采用丹東百特 BT-9300ST儀器，測定微球粒徑，以微球的平均粒徑(Y)為評價指標，建立數(shù)學模型，制備17批微球，優(yōu)化微球處方. 3因素3水平的BBD實驗設(shè)計見表1.

表1 BBD實驗因素水平表(n=3)

取凍干后樣品于無水乙醇中分散，將微球置于載玻片上，用顯微鏡觀察其微觀形態(tài)并拍照記錄. 樣品在紅外燈照射下烘干，以干燥的KBr壓片，分別測定HA、Pu、HA-Pu、HA與Pu的物理混合物、HA-Pu微球的紅外光譜圖，掃描波數(shù)4 000～400 cm-1，分辨率1 cm-1.

1.2.2 載藥微球體外釋放

配制鹽酸阿霉素標準品液和HA-Pu液，在190～500 nm處紫外掃描，藥物紫外最大吸收波長為254 nm，HA-Pu水溶液無干擾. 精密移取200 μg/mL鹽酸阿霉素標準液，配制4、6、8、10、12、14和16 μg/mL阿霉素溶液，于254 nm處測定吸光度，以吸收值對質(zhì)量濃度進行線性回歸，獲得阿霉素水溶液的標準曲線，考察阿霉素溶液樣品日內(nèi)和日間穩(wěn)定性.

依照BBD篩選最佳處方，滴加0.5 mol戊二醛，評價藥載比(DOX∶HA-Pu，質(zhì)量比)為1∶10、2∶10、2.5∶10、3∶10、4∶10的載藥微球載藥量與包封率，獲得最佳藥載比，制備載藥微球，備用. 在透析袋中放入1 mg/mL微球2 mL 混懸液，透析袋置于30 mL pH分別為1.2、6.8和7.4釋放液中，在(37±1 )℃，100 r/min恒溫振蕩，定時吸取透析外液8 mL，同時補充等溫等量緩沖液，254 nm處測定紫外吸收度，計算藥物質(zhì)量濃度和藥物累計釋放量.

取2 mg DOX-HA-Pu載藥微球置于5 mL蒸餾水中，超聲，4 000 r/min離心10 min，取上清液于254 nm處測定吸光度，依公式(1)和(2)分別計算微球的載藥量(DD)與包封率(EE).

(1)

(2)

式(1)、(2)中，M為制得DOX-HA-Pu微球的總質(zhì)量；M0為受試DOX-HA-Pu微球的質(zhì)量；M1為受試DOX-HA-Pu微球中DOX的測定值；M2為制備DOX-HA-Pu微球時DOX的投藥總量.

1.2.3 藥物在大鼠體內(nèi)藥代動力學的測定

用肝素處理過的EP管收集大鼠眼眶血，5 000 r/min的條件下離心10 min，取血漿，備用. 配制0.2 mg/mL的阿霉素標準儲備液，置于4 ℃冰箱，避光保存. 取阿霉素儲備液，用甲醇配1、5、10、20和40 μg/mL對照品液，分別取10 μL，加入空白血漿190 μL，渦旋混合，加三氯甲烷-甲醇(體積比4∶1)0.5 mL，渦旋混合，在8 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，50 ℃氮氣吹干，100 μL甲醇復(fù)溶，在10 000 r/min離心10 min，取20 μL進樣，以峰面積(Y)對血漿藥物質(zhì)量濃度(X，μg/mL)進行線性回歸，標準曲線方程為：Y=3 887.5X-1 114.8，R2=0.995(n=3)，在1～40 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好. 取健康雄性Wistar大鼠10只，隨機分為2組，禁食12 h，自由飲水，分為腹腔注射10 mg/kg DOX-HA-Pu 微球混懸液組和尾靜脈注射等量DOX藥物溶液組，給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36和48 h眼眶取血，離心，-20 ℃凍存，按照建立標準曲線的方法處理樣品，采用HPLC法測定藥物質(zhì)量濃度，繪制藥時曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 HA-Pu微球制備

表2 制備微球平均粒徑(n=3)

圖1 攪拌速度(X1)、油水相比(X2)和 HA-Pu溶液濃度(X3)影響的等值線和曲面

2.2 HA-Pu微球的表征

凍干微球樣品的光學顯微鏡圖，見圖2，微球球形圓整，表面光滑.紅外圖譜見圖3，HA(3a)、Pu(3b)、HA與Pu物理混合物(3c)、HA-Pu(3d)和HA-Pu 微球(3e)中存在大量—OH與—CH2—基團，3 200～3 600 cm-1顯示強的-OH伸縮振動峰，2 925 cm-1出現(xiàn)強的—H伸縮振動峰；HA、HA-Pu和HA-Pu微球中存在—NHCOCH3，故1 655 cm-1出現(xiàn)酰胺Ⅰ帶吸收峰，而Pu不含酰胺基團，在1 655 cm-1處未見吸收峰，HA與Pu物理混合物此波數(shù)的酰胺吸收峰不明顯；HA-Pu 微球相比HA-Pu 材料，在2 850 cm-1處出現(xiàn)游離醛基峰，1 733 cm-1處出現(xiàn)新羰基峰，而1 200～1 000 cm-1縮醛的C—O—C—O—C吸收峰增強，表明HA-Pu與戊二醛成功交聯(lián)形成微球[21]，制備交聯(lián)微球在光鏡下顯示出較好形態(tài)，見圖2.

圖2 透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖微球光學顯微鏡圖

a.透明質(zhì)酸;b. 普魯蘭糖;c. 透明質(zhì)酸普魯蘭糖混合物;d.透明質(zhì)酸-普魯蘭糖;e.透明質(zhì)酸-普魯蘭糖微球.

2.3 HA-Pu載藥微球制備

鹽酸阿霉素和HA-Pu水溶液的紫外掃描圖顯示，鹽酸阿霉素最大吸收波長在254 nm，HA-Pu溶液不干擾阿霉素的紫外吸收，測定阿霉素溶液標準方程為y=0.0494x+0.0011(R2=0.999)，檢測在4～16 μg/mL，阿霉素樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于2%. 采用BBD優(yōu)化條件，制備DOX-HA-Pu MPs，分別采用0.167、0.334、0.5和0.667 mol戊二醛交聯(lián)微球，考察微球載藥量. 結(jié)果顯示0.5 mol的戊二醛交聯(lián)，微球獲得5.02%最佳載藥量. 表3考察不同藥載比對HA-Pu MPs的載藥量和包封率，DOX與HA-Pu投料比為2∶10(質(zhì)量比)，DOX-HA-Pu MPs獲得最佳載藥量和包封率.

表3 DOX-HA-Pu MPs包封率(EE)和載藥量( DD)

2.4 DOX-HA-Pu MPs體外釋放

依最優(yōu)條件制備DOX-HA-Pu MPs，其在不同pH釋放介質(zhì)的釋藥曲線見圖4a.DOX-HA-Pu MPs 前4 h釋藥，在pH 6.8和7.4釋放介質(zhì)中分別達66%和64%，pH 1.2釋藥高達87%；24 h時pH 6.8和7.4釋放介質(zhì)釋藥均接近95%，顯示出一定緩釋行為. DOX-HA-Pu MPs最初4 h 內(nèi)釋放快，原因是吸附在微球表面和空隙內(nèi)藥物釋放導(dǎo)致，而后微球內(nèi)部的藥物通過微球骨架緩慢擴散或HA-Pu材料降解釋放，曲線趨于平緩. 將DOX-HA-Pu MPs的體外釋藥行為擬合,見圖4b，擬合度和釋放模型擬合結(jié)果見表4，由表4可知，DOX-HA-Pu MPs體外釋藥符合Ritger-Peppas方程，對于圓球形制劑，可根據(jù)Ritger-Peppas方程中t的指數(shù)n來推測藥物從微球骨架結(jié)構(gòu)中釋放機制，計算n=0.20≤0.43，故藥物的釋放以Fick’s擴散方式為主.

圖4 不同pH釋放介質(zhì)下DOX-HA-Pu MPs體外釋藥曲線(a)；pH 7.4釋放液的釋放模型擬合曲線(b)

表4 DOX-HA-Pu MPs不同模型的釋藥相關(guān)系數(shù)(R2)

2.5 載藥微球體內(nèi)藥代

測得HPLC條件下鹽酸阿霉素大鼠體內(nèi)的標準曲線方程：A=3 887.514x-1 114.813，R2=0.995(n=5)，在1～40 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好. 4 ℃放置5 d，樣品日內(nèi)日間精密度均符合要求. 圖5為Wistar大鼠尾靜脈注射DOX·HCl生理鹽水溶液和腹腔注射DOX-HA-Pu MPs微球液后的藥-時曲線，游離藥物注射達峰后迅速下降，24 h難檢測，半衰期短(t1/2，4.55 h)，代謝較快，與文獻報道的3.78 h一致[22]. 而腹腔注射DOX-HA-Pu MPs，t1/2延長至28.64 h，是游離藥物的6.3倍；體內(nèi)平均滯留時間(MRT)為16.77 h，是游離藥物的3.5倍，載藥微球組藥物清除率低. 采用DAS 2.0軟件處理藥代參數(shù)，主要結(jié)果見表5.

圖5 DOX·HCl和DOX-HA-Pu MPs的Wistar大鼠體內(nèi)藥-時曲線 (n=5)

表5 DOX·HCl和DOX-HA-Pu MPs在大鼠體內(nèi)藥代動力學參數(shù)(n=5)

T代表受試載藥微球制劑，iv表示靜脈注射DOX，D表示給藥劑量，得到載藥微球制劑的腹腔注射的絕對生物利用度為89.6%.

3 結(jié)論

采用乳化交聯(lián)和BBD法，優(yōu)化HA-Pu MPs制備處方，制備微球表面光滑，形態(tài)圓整且粒徑均勻，紅外譜圖顯示，成功獲得交聯(lián)微球. 以DOX·HCl為模型藥物，制備載藥量為5.02%的藥物微球制劑. 載藥微球體外釋放受介質(zhì)pH影響，偏酸介質(zhì)可加速微球釋藥，pH 7.4模擬體液釋放環(huán)境下，載藥微球釋藥符合Ritger-Peppas方程，其通過Fick's擴散機制釋藥. 對比大鼠尾靜脈注射DOX·HCl與腹腔注射DOX-HA-Pu MPs的藥代動力學參數(shù)，載藥微球釋放具備較好的緩釋能力.