張 凱,王 杰,李夢瑩,馬小靜,董 馨,孫鑫鵬,趙德明,周向梅,許立華

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川750021 ；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，國家動物傳染性海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室,北京海淀100193)

宿主防御肽又名抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，最早是由瑞典科學(xué)家Boman H G于1980年在天蠶蛹中發(fā)現(xiàn)的一類陽離子小肽類物質(zhì)，因其具有殺滅病原菌的作用，便被命名為抗菌肽[1]?？咕膹V泛存在于動植物和少量微生物體內(nèi)，是脊椎動物先天免疫的重要組成部分。作為一種分泌性蛋白，抗菌肽在機(jī)體抵抗病原微生物、新血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)和殺滅腫瘤細(xì)胞等方面扮演重要角色[2]。哺乳動物的AMPs有2個主要類別：防御素家族和Cathelicidin家族。防御素家族的大部分成員在C末端包含6個保守的半胱氨酸殘基，根據(jù)其半胱氨酸的間距模式分類為α、β或θ防御素[3]。Cathelicidin家族成員是在巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的溶酶體和角質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的多肽家族，其特征是保守的N端Cathelin結(jié)構(gòu)域和高度可變的C端抗微生物結(jié)構(gòu)域，通常為α螺旋或擴(kuò)張性的結(jié)構(gòu)。Cathelicidin家族成員存在于從魚類到哺乳動物類的脊椎動物中，許多哺乳動物都含有Cathelicidin基因。

人源抗菌肽LL37是目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一一種Cathelicidin家族抗菌肽，于1995年被發(fā)現(xiàn)，由位于3號染色體上的CAMP基因編碼，主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和各種上皮細(xì)胞的活性結(jié)構(gòu)域釋放[4]。LL37的前體是19.3 ku含信號肽的前原肽，C末端包含37個氨基酸殘基，無活性。去掉信號肽后為18 ku(hCAP-18)，經(jīng)細(xì)胞釋放后，C端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞外絲氨酸蛋白酶角質(zhì)層胰蛋白酶(SCTE)和角質(zhì)層胰凝乳蛋白酶(SCCE)的作用下產(chǎn)生有活性、分子質(zhì)量為4.5 ku的 LL37，其包含有6個靜正電荷，N末端疏水性很高,分子的中央部分殘基形成典型的雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)，具有線性結(jié)構(gòu)，無二硫鍵[5]。Cathelicidin的小鼠同系物CRAMP由CnlP基因編碼，其與CAMP基因相似，因此兩者具有相似的結(jié)構(gòu)及功能[6]。

LL37是一種多功能蛋白，其具有廣譜的抗微生物、抗毒素活性和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用。

能夠激活趨化性，連接先天免疫和獲得性免疫，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本文著重就LL37的直接及間接殺菌作用以及外源物質(zhì)促進(jìn)LL37分泌幫助機(jī)體抵抗病原微生物感染等方面進(jìn)行闡述，以期為后續(xù)開展的LL37在治療和預(yù)防疾病等方面的研究工作提供新的思路和方法。

1 LL37對病原微生物的直接殺滅作用

LL37具有廣譜的抗微生物活性，可以快速有效地抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌及部分病毒，其通過帶有陽離子并具有雙親性的表面螺旋結(jié)構(gòu)與真核細(xì)菌、原核細(xì)菌或病毒DNA和RNA以及CpG-寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)和雙鏈RNA(poly [I:C])通過靜電相互作用形成具有免疫刺激性的復(fù)合物，并且 LL37能夠直接穿過微生物細(xì)胞外層膜到達(dá)內(nèi)層細(xì)胞膜，并引起細(xì)胞膜的破壞，導(dǎo)致病原微生物死亡。

1.1 LL37的抗細(xì)菌作用 LL37與細(xì)菌脂多糖(LPS)結(jié)合抑制了LPS與LPS結(jié)合蛋白(LBP)的相互作用，阻止LPS轉(zhuǎn)移至其受體CD14，從而抑制其產(chǎn)生LPS性炎癥反應(yīng)及LPS性內(nèi)毒素休克[7]。阮洋等[8]在用脂磷壁酸(LTA)誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌感染的RAW264.7巨噬細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6及LL37表達(dá)量增加。外源加入LL37干預(yù)后，TNF-α、IL-6表達(dá)下降，由此可發(fā)現(xiàn)LTA可以引起巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，LL37減弱LTA引起的炎癥反應(yīng)。Stephan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，由中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(NET)產(chǎn)生的LL37/DNA復(fù)合物通過P2RX7受體與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入人外周血單核巨噬細(xì)胞，之后在通過溶酶體對BCG產(chǎn)生殺菌作用。此外，LL37能夠與表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等細(xì)菌帶負(fù)電荷的生物膜相互作用，從而破壞細(xì)菌生物膜，降低了細(xì)菌的粘附性，以實(shí)現(xiàn)抗菌作用[10]。

1.2 LL37的抗真菌作用 從目前的研究發(fā)現(xiàn)，LL37能夠抵抗假絲酵母菌、白念球菌感染。Chang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，LL37和防御素hBD-3同參與真菌細(xì)胞壁β-葡聚糖代謝的細(xì)胞壁β-1,3-外切葡聚糖酶Xog1p相結(jié)合，降低了白念珠菌的粘附能力。由此可見，LL37對真菌的作用機(jī)理與細(xì)菌相似，均通過作用于病原體生物膜，來實(shí)現(xiàn)抑菌功能。

1.3 LL37的抗病毒作用 從目前的研究發(fā)現(xiàn)，LL37能夠抵抗牛痘病毒、合胞體病毒、流感病毒、登革熱2型病毒、單純皰疹病毒、腺病毒以及免疫缺陷病毒1型、鼻病毒、肝炎病毒等病毒的感染。Merkle M等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LL37將可將胞外乙肝病毒DNA轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，并減弱由乙肝病毒DNA引起的炎癥反應(yīng)。Lai Y等[13]發(fā)現(xiàn)在氣道上皮細(xì)胞中，LL37通過雙鏈RNA病毒增強(qiáng)TLR3信號通路，從而促進(jìn)IL-1α、IL-6、IP-10、MCP-1等細(xì)胞因子的釋放。此外，LL37可以直接在體外抑制腺病毒和鼻病毒復(fù)制。

由此可見，LL37抵抗病原微生物機(jī)制包括： (1)通過靜電吸引與病原體膜結(jié)構(gòu)相互作用并破壞其包膜而實(shí)現(xiàn)直接抵抗功能；(2)抑制病原體蛋白；(3)調(diào)節(jié)宿主抗病原體免疫應(yīng)答。

2 LL37對病原微生物的間接殺滅作用

LL37不僅能夠直接對病原菌起到殺滅作用，而且能夠?qū)?xì)胞的生命活動產(chǎn)生影響，從而促進(jìn)機(jī)體對于病原微生物的清除作用。從目前的研究發(fā)現(xiàn)，LL37能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號通路并能夠?qū)?xì)胞自噬和凋亡產(chǎn)生影響。LL37不僅參與天然免疫，而且其作為多功能固有免疫效應(yīng)器，可募集并激活炎癥細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞。在單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，LL37通過表皮生長因子受體(EGFR)、甲酰肽受體樣1(FPRL1)、TLR4和TLR9驅(qū)動生物反應(yīng)，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒, 釋放組胺，調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[14]。

LL37對細(xì)胞的趨化作用通過G蛋白耦聯(lián)受體MrgX2、細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高、磷脂酶C激活這一途徑實(shí)現(xiàn)，G蛋白耦聯(lián)受體阻斷劑可阻斷 LL37 對細(xì)胞的趨化作用。除此之外，LL37可使單核細(xì)胞胞膜甘露糖受體表達(dá)升高，進(jìn)而使細(xì)胞抗原呈遞和內(nèi)吞作用增強(qiáng)。還能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化，并且促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的內(nèi)吞作用、吞噬受體的修飾、共刺激分子表達(dá)，增強(qiáng)Th1反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌[15]。Rokeya等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核分枝桿菌H37RV感染過程中，LL37通過激活P2RX7受體并激活胞內(nèi)游離Ca2+途徑、AMPK信號通路及PI3K信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并殺滅H37RV。Hu等[17]揭示了LL37通過中和LPS的作用并抑制核苷酸受體P2X7對ATP的反應(yīng)，在體外抑制LPS/ATP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的凋亡。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚損傷期間，LL37與MAVs信號通路促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分泌β干擾素。Pinegin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，DNA與抗菌肽LL37的復(fù)合物還可通過誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞釋放I型干擾素來增強(qiáng)NK細(xì)胞功能。除此之外，LL37還可通過mTOR信號通路維持線粒體穩(wěn)態(tài)，并影響NF-κB、Wnt/β-Catenin、PGE2-EP3 等多種信號通路。由此可見，LL37可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡與自噬、誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、并增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能來幫助機(jī)體清除病原微生物。

3 外源物質(zhì)促進(jìn)LL37的分泌抵抗病原微生物感染

作為一種抗病原體的功能性肽，細(xì)菌及其LPS是Cathelicidin家族類抗菌肽的強(qiáng)誘導(dǎo)源。但是，某些細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌等通過cAMP信號通路降低Cathelicidin表達(dá)[20]。此外，維生素D3、短鏈脂肪酸及其衍生物可以促進(jìn)細(xì)胞分泌抗菌肽。

3.1 丁酸鹽促進(jìn)LL37的表達(dá) 丁酸鹽是由膳食纖維在動物腸道菌群中的重要功能類群丁酸鹽產(chǎn)生菌(Butyrate-producing bacteria，BPB)的作用下產(chǎn)生的，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，對人體健康十分重要。在BPB缺失情況下，人類患有Ⅱ型糖尿病和腸炎的機(jī)率大大增加。結(jié)核病患者腸道內(nèi)BPB菌群受到改變，使機(jī)體免疫力降低[21]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽不僅可以促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞分泌LL37，而且丁酸鹽及其衍生物丁酸鈉、丁酸苯酯、丙戊酸等短鏈脂肪酸的另一個身份是組蛋白脫乙酰化酶抑制劑(HDACi)，可以調(diào)控組蛋白去乙酰化，從而影響機(jī)體多種基因的轉(zhuǎn)錄。另外，丁酸鹽能夠通過調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體以及NF-κB、Wnt/β-Catenin、JAK2/STAT、Notch1等信號通路，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的釋放從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖活化，維持機(jī)體免疫平衡[22]。除此之外，Han等[23]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以上調(diào)MiR-203的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。除此之外，HADCi族的其他成員，如TSA、芳?；蕉奉愇镔|(zhì)，亦能促進(jìn)LL37的表達(dá)。

3.2 VD3促進(jìn)LL37的表達(dá) 維生素D3(VD3)是人體生長發(fā)育中必不可少的元素，其與骨骼發(fā)育和鈣的吸收息息相關(guān)。VD3需要在體內(nèi)經(jīng)歷2次羥基化才變得具有生物活性。血液中的VD3在肝臟中羥化酶(CYP27A1)羥化成25(OH)D3，然后在局部組織1α-羥化酶(CYP27B1)羥化成活性的1,25-(OH)2D3形式。進(jìn)而在循環(huán)系統(tǒng)中與VD結(jié)合蛋白(VDBP)結(jié)合，輸送到各組織細(xì)胞，與VDBP分開并與VD3核受體(VDR)結(jié)合。該復(fù)合物與維甲酸X受體二聚體化，產(chǎn)生的異源二聚體為一個有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控約900多個基因的表達(dá)，其中抗菌肽CAMP基因就包含在其中，該途徑是VD3在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮其活性的主要途徑[24]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-1β等能夠上調(diào)免疫細(xì)胞中的CYP27B1和CYP24A1的表達(dá)，導(dǎo)致單核細(xì)胞中Cathelicidin表達(dá)增強(qiáng)。在細(xì)胞中IL-15介導(dǎo)的TLR2/1配體受到刺激后，編碼VDR和CYP27B1的基因被上調(diào)，導(dǎo)致LL-37表達(dá)增強(qiáng)[25]。但是，在小鼠、大鼠和犬體內(nèi)CRAMP基因的啟動子中缺乏VDR受體，使得VD3不能誘導(dǎo)鼠及犬模型的Cathelicidin抗菌肽的表達(dá)[26]。

大量研究數(shù)據(jù)證實(shí)，使用丁酸鹽及VD3等物質(zhì)，能夠幫助機(jī)體產(chǎn)生LL37從而抵抗病原微生物感染。外源物質(zhì)促進(jìn)抗菌肽的分泌為預(yù)防和治療疾病提供了新的思路。

4 小結(jié)

對于抗菌肽的研究，為防止病原微生物感染以及某些自身免疫疾病提供了新的思路。從青霉素普及至今的70年間，抗生素的過度使用造成越來越多的細(xì)菌發(fā)展成為對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥的菌株，甚至產(chǎn)生多耐藥和超耐藥菌株。耐藥結(jié)核分枝桿菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)等的出現(xiàn)，使得人類對于病原菌的進(jìn)化能力措手不及。傳統(tǒng)抗生素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、干擾蛋白質(zhì)的合成、阻斷細(xì)菌核酸合成、影響細(xì)菌轉(zhuǎn)錄這4種方式殺滅病原微生物。然而，此類傳統(tǒng)的抗生素作用機(jī)制，已經(jīng)在長時期大劑量使用的持續(xù)刺激下，使某些細(xì)菌的基因發(fā)生進(jìn)化，并且這些耐藥基因可不斷傳播。耐藥菌株通過產(chǎn)生抗生素相應(yīng)的水解酶、改變菌體通透性、增加外排能力或者改變菌體內(nèi)靶位結(jié)構(gòu)等方式對抗生素產(chǎn)生抵抗。

為了能夠解決這種日益嚴(yán)峻的問題，研究人員正努力尋找能夠替代傳統(tǒng)抗生素的新型抗菌藥物。以LL37為主的抗菌肽便受到研究人員的重視。由于其抗菌活性高、細(xì)胞毒性低、抗菌譜廣、種類多、可供選擇的范圍廣、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，使其成為一種新型抗菌藥物。至今，科研人員已經(jīng)從昆蟲、哺乳動物、魚類及兩棲動物，甚至是植物和少數(shù)細(xì)菌上都分離到抗菌肽并進(jìn)行了深入的研究。不僅如此，抗菌肽及其衍生物已經(jīng)在體外表達(dá)，并用于臨床治療。隨著科研人員對于抗菌肽的繼續(xù)研究，抗菌肽的功能將會被更進(jìn)一步的挖掘出來，為人類預(yù)防及治療疾病發(fā)揮更大的作用。