李 帥，鮑翠玉，李 晶

(湖北科技學(xué)院1. 藥學(xué)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100)

據(jù)報(bào)道，高脂刺激可誘發(fā)心肌細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)異常激活或線粒體介導(dǎo)的凋亡[1]。吲哚三甲醇(indole-3-carbinol，I3C)屬于如甘藍(lán)、白菜等十字花科蔬菜中的有效成分[2,3]，I3C對(duì)心肌細(xì)胞脂毒性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制目前尚無報(bào)道。本研究將探討I3C對(duì)高脂所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制與ERS-線粒體凋亡通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2心肌細(xì)胞，購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；胎牛血清購(gòu)自北京裕恒豐科技有限公司；MTT檢測(cè)試劑盒、I3C、PA購(gòu)自Sigma公司；一抗和二抗購(gòu)自CST公司。

1.2 方法

1.2.1MTT檢測(cè) 細(xì)胞加入96孔板，37 ℃內(nèi)放置24 h，細(xì)胞貼壁后分組給藥進(jìn)行孵育，加入 MTT孵育4 h，再加入 150 μL DMSO，振蕩混勻后，檢測(cè)570 nm處OD值。

1.2.2ROS水平檢測(cè) 6孔板內(nèi)加入玻片，并加入細(xì)胞在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h，細(xì)胞貼壁后分組給藥，經(jīng)洗滌、固定、再洗滌后，加入DHE(10 mmol·L-1)探針，37℃孵育30 min，洗滌、封片后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光。

1.2.3線粒體膜電位檢測(cè) 6孔板內(nèi)加入玻片，并加入細(xì)胞在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h，細(xì)胞貼壁后分組給藥，經(jīng)洗滌、固定、再洗滌后，加入JC-1探針，37℃孵育20 min，洗滌、封片后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光。

1.2.4免疫印跡法檢測(cè) 取20 μL的蛋白樣品，分組加入樣品槽內(nèi)，進(jìn)行蛋白電泳，并經(jīng)轉(zhuǎn)模及封閉后，進(jìn)行下列抗體的孵育：GRP78、CHOP、p-PERK、p-IRE1、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2。一抗孵育結(jié)束后進(jìn)行二抗孵育，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異的分析采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 I3C對(duì)高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖能力低下的影響我們用MTT實(shí)驗(yàn)觀察了心肌細(xì)胞增殖率，發(fā)現(xiàn)PA刺激心肌細(xì)胞出現(xiàn)濃度依賴性及時(shí)間依賴性降低趨勢(shì)，尤其PA在0.4 mmol·L-1刺激24 h時(shí)心肌細(xì)胞增殖率出現(xiàn)明顯降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。I3C在200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯恢復(fù)至正常水平，因此在下一步實(shí)驗(yàn)中I3C濃度設(shè)置為200 μmol·L-1。

2.2 I3C對(duì)高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及線粒體膜電位的影響ROS用紅色熒光標(biāo)記，PA組出現(xiàn)顯著增強(qiáng)，PA+I3C組較PA組顯著降低，說明PA顯著增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，I3C預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)此改變；另一組數(shù)據(jù)表明，PA組線粒體膜電位顯著下降，I3C預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)此改變。

2.3 I3C對(duì)高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERS-線粒體凋亡通路的影響PA組GRP78、CHOP、p-PERK及p-IRE1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；預(yù)處理I3C可以顯著降低上述蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。PA組Bcl-2水平明顯下降(P<0.05)，Bax、cleaved caspase-3水平均明顯升高(P<0.05)，而預(yù)處理I3C組可以明顯逆轉(zhuǎn)上述改變(P<0.05)。

3 討論

本研究證實(shí)，心肌細(xì)胞對(duì)脂毒性損傷損傷比較敏感，會(huì)導(dǎo)致生存率的降低及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的增加，最終誘發(fā)凋亡，預(yù)處理吲哚三甲醇可以明顯逆轉(zhuǎn)這些改變，有效抑制心肌細(xì)胞的損傷。

我們進(jìn)一步觀察了ERS-線粒體凋亡通路和吲哚三甲醇作用機(jī)制的相關(guān)性。據(jù)報(bào)道，ERS的活化與線粒體細(xì)胞凋亡通路有一定相關(guān)性[4]。本研究結(jié)果提示，當(dāng)心肌細(xì)胞受到脂毒性損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白及線粒體促凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，抗凋亡蛋白表達(dá)明顯減少，而吲哚三甲醇預(yù)處理可以明顯逆轉(zhuǎn)上述變化。

綜上，I3C能成功逆轉(zhuǎn)高脂所致的心肌細(xì)胞增殖力下降，緩解氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能紊亂，本研究證實(shí)此作用與ERS-線粒體凋亡通路的調(diào)控密切相關(guān)。