王達(dá)洋，王顯，2*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所，北京 100700)

目前，心腦血管疾病仍是威脅人類健康的頭號(hào)殺手，而動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起急性心肌梗死、卒中等重大疾病的首要病因[1]。 以小型豬為代表的大動(dòng)物模型因在動(dòng)脈解剖、生理等方面與人類更為相似，因此在心血管相關(guān)研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)。 在小型豬AS 模型的構(gòu)建中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量的探索[2]，但目前尚無成熟、公認(rèn)的小型豬AS 模型。 模型的成功構(gòu)建與小型豬的品系、適宜的造模方法均密切相關(guān)，且需要使用合理的方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 現(xiàn)就小型豬AS 模型的相關(guān)問題綜述如下。

1 用于構(gòu)建AS 模型的小型豬品系

目前用于構(gòu)建小型豬AS 模型的國(guó)內(nèi)品系有中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬、巴馬小型豬、五指山小型豬、貴州小型豬等；國(guó)外品系包括尤卡坦小型豬、Obbassaw小型豬及Rapacz 豬等。

1.1 國(guó)內(nèi)品系

1.1.1 中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬

中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬(Chinese Experimental Minipigs，CEMP)也被稱為農(nóng)大小型豬。 該品種是由廣西、貴州引進(jìn)的香豬繁育而來，分為三大品系[3]，其中農(nóng)大II 系在心血管器械領(lǐng)域有較多的應(yīng)用，其對(duì)應(yīng)激的耐受程度較好，手術(shù)死亡率低，這些優(yōu)勢(shì)使得其在心臟介入領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。但近年來鮮有基于該品系的研究結(jié)果發(fā)表，提示近年來該品系可能較難獲得。

1.1.2 巴馬小型豬

巴馬小型豬是目前用于心血管研究最常用的小型豬動(dòng)物模型，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于小型豬AS 模型的構(gòu)建大多是基于該品系[4-5]。 雖然與農(nóng)大II 系相比，該品系體型略大，抗應(yīng)激能力略弱，但目前是可獲取的最佳品種。

1.1.3 五指山小型豬

五指山小型豬是國(guó)內(nèi)另一種較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，具有體型小[6]，對(duì)高脂飼喂敏感[7]的優(yōu)勢(shì)。但五指山小型豬的缺點(diǎn)對(duì)于侵入性操作的耐受性較低，手術(shù)過程中容易發(fā)生室顫而死亡[8]。

1.1.4 其他

目前國(guó)內(nèi)使用的小型豬還包括貴州小型豬、西藏小型豬和版納小型豬，目前在報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)中較少使用。

1.2 國(guó)外品系

1.2.1 尤卡坦小型豬

尤卡坦小型豬原產(chǎn)于墨西哥尤卡坦半島，經(jīng)過封閉培育使得品種體型減小。 目前該品系是北美應(yīng)用最廣泛的品系。 除采用傳統(tǒng)的造模方法外，還可通過基因編輯方法誘導(dǎo)家族性高脂血癥小型豬。該品系具有體型小，遺傳穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)[9]。

1.2.2 Ossabbaw 豬

Ossabbaw 豬是由原歐洲品系的豬經(jīng)過長(zhǎng)期的地理隔離，進(jìn)化出適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的特性，具備強(qiáng)大的脂肪儲(chǔ)備能力。 較其他品系Ossabbaw 豬容易通過高脂高糖飼喂誘導(dǎo)代謝綜合征[10]，是目前研究代謝綜合征合并AS 的重要品系。

1.2.3 Rapacz 豬

Rapacz 豬最早由Rapacz 報(bào)道，由此得名。 該品系天然具有家族性高脂血癥，可自發(fā)性出現(xiàn)AS，因此在AS 的研究中應(yīng)用十分廣泛。 該品系載脂蛋白B 基因及LDLR 基因突變[11-12]是其家族性高脂血癥的原因。 但該品系體型較大，不利于操作，和中國(guó)梅山豬雜交后得到體型較小的品種，即FBM 豬[13]，更具備可操作性。

2 構(gòu)建小型豬AS 模型的方法

目前用于構(gòu)建小型豬AS 模型的思路大致可分為兩類，一類是通過誘導(dǎo)小型豬高膽固醇血癥，促進(jìn)AS 斑塊形成；另一類為使用手術(shù)法，通過對(duì)動(dòng)脈壁的定向損傷或促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加速AS 斑塊的形成。

2.1 高脂血癥誘導(dǎo)AS 的形成

2.1.1 小型豬的高脂飲食

高膽固醇血癥是AS 形成最重要的環(huán)節(jié)，因此目前小型豬AS 模型多以高脂飼料的喂養(yǎng)作為模型構(gòu)建的基礎(chǔ)方法。 盡管高脂飼喂法早在20 世紀(jì)70年代已被采用[14]，但至今仍是模擬AS 模型最重要的方法。 單純高脂飼喂法十分簡(jiǎn)便，而且模擬了人類AS 的形成過程，但其缺點(diǎn)是：成模率低，AS 形成的位置、大小、程度均不可控；成本高，長(zhǎng)期高脂飼喂造成時(shí)間成本與價(jià)格成本高昂[7]。 這些因素是制約目前小型豬AS 模型發(fā)展的瓶頸。

此外，在各項(xiàng)研究中，高脂飼料的配方不盡相同。 小型豬高脂飲食的基本組成成分為：基礎(chǔ)飼料(約80%)，膽固醇(0.5% ～6%)，飽和脂肪酸(約15%)，膽鹽(0.5% ～2%)，微量元素預(yù)混料及調(diào)味劑等[15]。 不同研究中所采用不同高脂飼料的主要區(qū)別在于膽固醇的含量：低劑量(≤1%)膽固醇的高脂飼料多用于兔模型的研究而較少用于小型豬的造模[16-17]；中劑量(1.5% ～5%)及高劑量(≥5%)膽固醇高脂飼料在小型豬模型中均有應(yīng)用，但由于高膽固醇含量的增高并未顯著增加AS 的形成速度及程度[15]，結(jié)合成本，目前研究多采用膽固醇含量為1.5% ～3%的飼料進(jìn)行小型豬的造模。

2.1.2 基因編輯構(gòu)建自發(fā)性高脂血癥

基因編輯技術(shù)為小型豬AS 模型構(gòu)建的加速創(chuàng)造了有利的條件。 通過基因改造，使得小型豬攜帶家族性高脂血癥基因，大幅提升基礎(chǔ)血漿膽固醇水平，從而加速AS 的形成。 目前試驗(yàn)成功的基因編輯方法包括低密度脂蛋白受體敲除(Low Density Lipoprotein Receptor-Knock off，LDLR-KO)、ApoE-KO以及D374Y-PCSK9 功能獲取(Gain of Function，GOF)三類。

(1)LDLR-KO

LDLR 表達(dá)于肝細(xì)胞表面，可與血液中的LDLC 特異性結(jié)合，通過胞吞作用，將LDL-C 吞入細(xì)胞內(nèi)并在酸性條件下相互分離，LDL-C 被溶酶體降解，LDLR 返回細(xì)胞表面繼續(xù)發(fā)揮作用[18]。 通過敲除LDLR 基因，可使血液中LDL-C 升高，從而誘發(fā)AS。上文所述的Rapacz 豬即是因LDLR 受體天然變異引起家族性高脂血癥及自發(fā)性AS，雖然該品系過大的體型和個(gè)體間的差異[19]限制了其廣泛的應(yīng)用，但為L(zhǎng)DLR-KO 小型豬模型的構(gòu)建提供了思路。

基于該方案，Bryan 等[20]通過體細(xì)胞和移植技術(shù)構(gòu)建了LDLR-KO 尤卡坦小型豬，聯(lián)合高脂飼喂制作AS 模型。 經(jīng)過6 個(gè)月高脂飼喂，在動(dòng)物的腹主動(dòng)脈可觀察到(56.6 ± 26.7)%的直徑狹窄，并在冠狀動(dòng)脈中觀察到(18.1 ± 4.6)%的面積狹窄。 在另一項(xiàng)研究中，Li 等[21]使用Landrace 與白豬的雜交品系成功制作了LDLR-KO 小型豬，合并4 個(gè)月的高脂飼喂后，盡管在冠狀動(dòng)脈中未表現(xiàn)出嚴(yán)重的狹窄，但其斑塊的特征與人類晚期AS 斑塊相符。 此外，Ogita 等[22]基于LDLR-KO 敲除的小型豬聯(lián)合高脂飼料+球囊拉傷法模擬AS 模型，該模型高脂飼喂的時(shí)間為12 個(gè)月，病理結(jié)果顯示其斑塊特征與晚期AS 相符，即纖維成分外層包繞的脂質(zhì)核心，但該研究并未報(bào)道其造成冠狀動(dòng)脈狹窄的具體程度。

LDLR 敲除是采用基因編輯制作小型豬自發(fā)性高脂血癥研究時(shí)間最常、最成熟的方法。 其最大的優(yōu)勢(shì)在于可以成功構(gòu)建與人AS 類似的病變，且更高的血脂水平使得其較單純高脂飼喂法已顯著降低成模時(shí)間，但均一性差是目前LDLR-KO 小型豬模型所共有的問題。

(2)ApoE 敲除

ApoE 是載脂蛋白中的一類，在調(diào)節(jié)血脂方面，ApoE 是VLDL 的組成成分，介導(dǎo)了VLDL 與LDLR的結(jié)合，促進(jìn)血液VLDL 的清除。 如ApoE 變異或表達(dá)量降低，將導(dǎo)致VLDL 清除減緩，血液VLDL 及LDL 水平升高而誘發(fā)AS[23]。 基于該思路，已構(gòu)建了多種自發(fā)性AS 的動(dòng)物模型。

Shim 等[23]使用尤卡坦小型豬構(gòu)建了ApoE-KO模型。 在血脂方面，與野生型相比，ApoE-KO 動(dòng)物的總膽固醇顯著升高，升高的主要成分為IDL 和VLDL，這與ApoE 的生理作用相吻合。 在誘導(dǎo)的斑塊方面，ApoE-KO 動(dòng)物的斑塊覆蓋面積較野生型顯著增加，顯示了AS 形成的加速。 此后，為構(gòu)建適合國(guó)內(nèi)使用的自發(fā)性高脂血癥動(dòng)物模型，方斌等[4]通過CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建ApoE 敲除的巴馬小型豬，經(jīng)高脂飼料6 個(gè)月，在主動(dòng)脈內(nèi)觀察到AS 面積約為(46.13 ± 6.13)%，具有良好的均一性。 除此以外，有兩項(xiàng)研究[5，24]報(bào)告了基于ApoE 及LDLR雙基因敲除的巴馬小型豬，可顯著增高LDL-C、TC、ApoB 的水平，但未報(bào)告所產(chǎn)生的AS 的程度。

ApoE 敲除小型豬的研究目前均未報(bào)道誘導(dǎo)AS引起最大管腔狹窄程度以及AS 斑塊的病理特征，即與人類晚期AS 斑塊的相似程度，是目前相關(guān)研究所共有的局限。

(3)D374Y-PCSK9 GOF

PCSK9 是一種肝源性蛋白，具有多種生物學(xué)功能。 在血脂調(diào)節(jié)方面，PCSK9 可與LDLR 結(jié)合提高LDLR 與LDL 的親和力，導(dǎo)致LDLR 與LDL-C 緊密連接而無法在細(xì)胞內(nèi)分離，最終LDLR、LDL-C 和PCSK9 一同被降解，細(xì)胞表面的LDLR 數(shù)量減少，導(dǎo)致循環(huán)中的LDL-C 水平升高[25]。 PCSK9 的突變體D374Y-PCSK9 致LDLR 降解的作用遠(yuǎn)超過野生型[26]，D374Y-PCSK9 GOF 小型豬的構(gòu)建即是基于該思路。

Al-Mashhadi 等[27]使用D374Y-PCSK9 GOF 克隆尤卡坦小型豬聯(lián)合高脂飼喂，與單純高脂飼喂組相比，將動(dòng)脈粥樣硬化面積提高了2.1 倍，狹窄程度增加1.8 倍，且形成的AS 斑塊與人類的較相似。但該研究并未設(shè)定時(shí)間梯度，高脂飼喂的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)46 周，并未驗(yàn)證該模型對(duì)AS 形成的加速作用。Fang 等[28]使用D374Y-PCSK9 GOF 克隆Ossabaw 小型豬，聯(lián)合高脂飼喂6 個(gè)月后，可觀察到LAD、RCA中均出現(xiàn)直徑狹窄18% ～37%，病變長(zhǎng)度9.9 ～38.3 mm 的斑塊，采用組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，這些斑塊中80%以上均符合晚期斑塊的特征。

LDLR、ApoE、PCSK9 是近年來發(fā)現(xiàn)的高膽固醇血癥的三大主效基因[29]，對(duì)這三種基因進(jìn)行編輯均大幅提升了小型豬血漿膽固醇濃度及AS 形成的速度。 在不同品系中，同樣的基因編輯策略所產(chǎn)生的血脂升高幅度及AS 形成速度有差異，這與不同品系對(duì)高膽固醇血癥的易感性密切相關(guān)。

2.2 手術(shù)法誘導(dǎo)AS 形成

對(duì)于小型豬AS 模型而言，即便自發(fā)性高脂血癥動(dòng)物可在短時(shí)間內(nèi)自發(fā)形成AS 斑塊，但這些斑塊的產(chǎn)生的部位、程度是隨機(jī)的。 由于AS 在動(dòng)脈內(nèi)產(chǎn)生的位置無法預(yù)測(cè)，由此構(gòu)建的動(dòng)物模型無法用于評(píng)價(jià)特定血管(如冠狀動(dòng)脈)的植入器械。 為解決這一問題，已有研究探索使用手術(shù)法定點(diǎn)構(gòu)建AS 斑塊，包括球囊拉傷法和血管壁內(nèi)注射法。

2.2.1 球囊拉傷法

球囊拉傷法是最早用于小型豬AS 造模的輔助方法。 該方法是通過介入手術(shù)，將大于血管直徑10% ～30%的球囊于目標(biāo)血管位置進(jìn)行擴(kuò)張，以損傷動(dòng)脈內(nèi)膜[22]。 聯(lián)合高脂飼喂，這一方法模擬了人AS 形成的內(nèi)皮損傷-脂質(zhì)沉積的過程。 球囊拉傷法在一定程度上加重了AS 的程度，加快其形成的速度，且使得病變產(chǎn)生的位置可以預(yù)測(cè)[13]，因此是目前較廣泛使用的方法。

盡管使用高脂飼料+球囊拉傷法模擬小型動(dòng)物如兔類等的AS 模型已十分成熟[30-31]，但基于小型豬的研究，這一方法仍然存在爭(zhēng)議。 高脂飼料聯(lián)合球囊拉傷誘發(fā)的病變與人類AS 病變的結(jié)構(gòu)存在差異，球囊損傷后所產(chǎn)生的血管反應(yīng)以內(nèi)膜增生為主，在病理學(xué)上，內(nèi)膜增生以增殖的血管平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)為主，大多不伴有壞死核心，與典型的晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊截然不同[32]。 除此以外，還有研究表明，在球囊損傷后血管內(nèi)植入支架與在正常血管植入支架所引起的支架內(nèi)再狹窄的程度及病理類型無明顯差異[33]，因而造模的意義有待商榷；上述爭(zhēng)議使得這一方法一直未獲得公認(rèn)。

2.2.2 動(dòng)脈壁局部注射法

由于ox-LDL 是AS 發(fā)病的使動(dòng)病因，通過血管壁內(nèi)注射的方法提高局部LDL 濃度，理論上可加速AS 的形成，且較構(gòu)建高脂血癥而言成本可顯著降低。 基于該思路Granada 等[34]進(jìn)行了首次探索。使用注射導(dǎo)管將膽固醇亞油酸注射于普通家豬的冠狀動(dòng)脈及髂動(dòng)脈壁中，后經(jīng)過4 周的高脂飼喂，成功在75%的注射節(jié)段制造了(36 ± 8)%的狹窄，且上述狹窄均具有脂質(zhì)核心。 后續(xù)該團(tuán)隊(duì)采用人ox-LDL 進(jìn)行注射，并聯(lián)合球囊拉傷，經(jīng)過平均8.2 周的高脂飼喂，模擬出(58.9 ± 14.0)%的AS 病變[34]，具有較好的均一性。 但后續(xù)研究逐漸暴露了該方法的問題。 Tellez 等[35]的結(jié)果顯示盡管脂質(zhì)組MCP-1 與新生血管密度高于生理鹽水組，但狹窄程度與面積兩組間并無差異。 Buszman 等[36]未采用高脂飼喂，僅在球囊拉傷后局部注射LDL，觀察周期為28 d，但結(jié)果僅OCT 評(píng)價(jià)LDL 組狹窄面積及程度顯著高于對(duì)照組，且構(gòu)成狹窄的物質(zhì)主要為平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。

除注射LDL 外，還可通過該方法局部注射炎癥因子，增加動(dòng)脈血管壁局部炎癥反應(yīng)程度進(jìn)而加速AS 的形成。 這一思路在兔模型中已誘導(dǎo)了晚期的AS 斑塊的形成[37]，但在基于其他動(dòng)物的模型報(bào)道較少。 Lee 等[38]探索使用該方法構(gòu)建小型豬AS 模型，使用注射導(dǎo)管將HMGB1 及TNF-α 分別注射入小型豬冠脈及髂動(dòng)脈內(nèi)，聯(lián)合8 周高脂飼喂及球囊拉傷，構(gòu)建了程度中等且均一性好的斑塊模型。 但這一方法仍然具有無法模擬人類晚期AS 斑塊的特征。

因此，即便局部注射法較構(gòu)建高脂血癥效率更高，花費(fèi)更低，且具有良好的均一性，但其模擬的動(dòng)脈狹窄的結(jié)構(gòu)與人類AS 斑塊存在一定的差異，即具有豐富的平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，但沒有脂質(zhì)核心、鈣化等，是該方法的缺陷所在。

2.3 其他

除上述方法外，通過誘導(dǎo)糖尿病來加速AS 斑塊的形成的方案也已有多項(xiàng)研究發(fā)表[39-40]。 在這些研究中建立了DM/HC 小型豬模型，即通過鏈脲佐菌素殺傷胰島β 細(xì)胞誘導(dǎo)豬血糖升高，再聯(lián)合高脂飼喂誘導(dǎo)高脂血癥，明顯加快了AS 的生成速度。但臨床合并AS 的糖尿病患者多為II 型糖尿病，同時(shí)合并代謝綜合征，而DM/HC 豬是I 型糖尿病模型，顯然無法與臨床實(shí)際結(jié)合。 相比之下，Ossabaw豬因易通過飲食誘導(dǎo)高脂血癥及代謝綜合征[10]，而在AS 的相關(guān)研究中廣泛使用。 但通過誘導(dǎo)糖尿病加速AS 形成的方法依然存在均一性較差的問題，目前仍難以解決。

3 小型豬AS 模型構(gòu)建的問題

盡管構(gòu)建小型豬AS 模型的研究已有數(shù)十年，但面臨的主要問題仍未有實(shí)質(zhì)性的突破。 這些問題包括：難以在短期內(nèi)構(gòu)建與人類類似的晚期AS斑塊；AS 狹窄程度、范圍及位置具有較高的異質(zhì)性；高脂飼喂誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高昂。 目前尚無方法能較好的解決上述所有的問題。

除此以外，在模型的評(píng)價(jià)方法上同樣存在問題。 多數(shù)文獻(xiàn)僅報(bào)道血脂、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index，AI)等指標(biāo)，這些指標(biāo)固然重要，但更重要的是對(duì)AS 的范圍、程度、結(jié)構(gòu)、分期進(jìn)行多維度的評(píng)價(jià)。 評(píng)價(jià)方法中，組織病理學(xué)應(yīng)是所有評(píng)價(jià)方法中最必要的手段；而在動(dòng)物取材之前，進(jìn)行適宜的影像學(xué)檢查，包括超聲、造影、OCT、IVUS等，也是模型評(píng)價(jià)的重要工具。 筆者認(rèn)為研究中應(yīng)報(bào)告除組織病理學(xué)外至少一項(xiàng)影像學(xué)指標(biāo)，以對(duì)AS模型進(jìn)行規(guī)范的評(píng)價(jià)。 目前國(guó)內(nèi)較多數(shù)研究尚未采用合理的方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，或未在文獻(xiàn)中進(jìn)行報(bào)告，是需要解決的重要問題之一。

4 總結(jié)

小型豬模型對(duì)于AS 的研究具有非凡的意義，經(jīng)過數(shù)十年的研究，已有多項(xiàng)行之有效模型構(gòu)建方法相繼發(fā)表，盡管目前各類模型均存在不足，但已為未來的研究提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)。 本文將這些研究綜述如上，以啟發(fā)同行，為助力AS 相關(guān)研究提供思路。