方曉露 徐冬娟 胥明遠 張紅梅 蔣宗英 呂懷盛，寧夏醫(yī)科大學病理學與病理生理學系（銀川75000）；寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院病理科（銀川75000）；寧夏醫(yī)科大學藥學院（銀川75000）；深圳市婦幼保健院病理科（深圳5808）

PKC家族激酶（protein kinase Cs，PKCs）在20世紀80年代初期，由于其作為自然致癌物佛波酯（phorbol ester，TPA/PMA）的底物誘導小鼠皮膚癌的發(fā)生而備受關(guān)注［1］。佛波酯協(xié)同Ras癌基因誘導細胞轉(zhuǎn)化，同時也發(fā)現(xiàn)有二酰基甘油（DAG）的表達異常，隨后進一步研究發(fā)現(xiàn)PKCs與fos和Myc等癌基因的功能密切相關(guān)［2］，從而將PKCs置于腫瘤信號通路的中心位置。蛋白激酶Cε（PKCε）屬于新型PKC（novel PKC，nPKC）中的一種［3］。已有研究表明PKCε在乳腺癌細胞系中表達明顯高于其在永生化的正常乳腺上皮細胞中的表達［4］，但其在正常乳腺與乳腺癌組織中的表達缺乏系統(tǒng)觀察，本研究采用免疫組化方法檢測PKCε蛋白在人正常乳腺組織和乳腺非特殊型浸潤性癌中的表達，觀察PKCε的過量表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月至2017年12月寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除且經(jīng)病理證實的存檔標本，包括正常乳腺組織（33例）、導管原位癌（26例）、浸潤性乳腺癌（126例，包括非特殊型浸潤性癌108例、典型髓樣癌11例及浸潤性微乳頭狀癌7例）。所有標本均采用4%的中性福爾馬林固定6～24 h。正常乳腺病例中位年齡47（36～62）歲，乳腺導管原位癌患者中位年齡為47（34～62）歲，浸潤性乳腺癌患者中位年齡53（29～83）歲；126例浸潤性癌按TNM分期標準進行分期，其中TNMⅠ期38例、TNMⅡ期67例、TNMⅢ期20例，Ⅳ期1例；1且均根據(jù)Nottingham改良方案進行組織學分級：Ⅰ級31例，Ⅱ級55例，Ⅲ級40例。

1.2 方法采用EliVision免疫組化方法常規(guī)檢測ER、PR、HER2、Ki-67。即用型鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（PV9000）、兔抗人PKCε多克隆抗體（TA327275s）、DAB kit（ZLI-9019）、ER（ZA-0102）、PR（ZM-0215）、HER2（ZA-0023）及Ki-67（UMAB107）均購自北京中杉金橋公司。

3 μm切片常規(guī)脫蠟水化后采用pH 8.0的枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復，山羊血清封閉，滴加一抗PKCε（1∶100稀釋）4℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min，PBS充分洗滌后，滴加二抗室溫孵育30 min，充分洗滌后采用新鮮配制的DAB顯色5 min，水洗后蘇木素復染，中性樹膠封片。實驗中應用了鼠IgG及PBS代替一抗作為陰性對照，同時選擇PKCε蛋白陽性染色的乳腺癌切片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定結(jié)果采用半定量法，根據(jù)細胞染色的強度和陽性細胞的百分數(shù)分別進行評分，再將二者的得分相乘計算免疫組化總評分。染色強度評分：0分：無色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。陽性細胞率評分：0分：陽性細胞＜10%；1分：陽性細胞占10%～25%；2分：陽性細胞占26%～50%；3分：陽性細胞＞50%?？偟梅?、1分為陰性，2、3分為陽性，4分以上為強陽性。ER、PR、Ki-67及HER2的判斷根據(jù)全國乳腺癌ER、PR［5］、Ki-67及HER2免疫組化檢測的共識標準進行判斷，HER2免疫組化結(jié)果為2+者，進一步采用FISH檢測明確HER2是否擴增。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，PKCε的表達與乳腺非特殊型浸潤性癌的臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗分析；當1≤理論頻數(shù)＜5時，采用Fisher精確概率法分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PKCε在乳腺浸潤性癌中的表達PKCε在乳腺浸潤性癌中的表達高于其在正常乳腺組織和乳腺導管原位癌中的表達，且其表達水平與乳腺癌的組織學類型相關(guān)。PKCε在正常乳腺組織、乳腺導管原位癌組織中均有表達，但水平較低，強陽性率分別為27.27%、19.23%；但在乳腺浸潤性癌中表達水平明顯增加，強陽性率為50.79%，明顯高于其在正常乳腺組織（χ2=6.185，P=0.045）、乳腺導管原位癌組織（χ2=9.573，P=0.008）中的表達。126例乳腺浸潤性癌中，有乳腺非特殊型浸潤性癌108例，其中有58例PKCε過量表達，強陽性率達53.70%；7例微乳頭狀癌組織中有6例PKCε過量表達，強陽性率達85.71%，而11例典型髓樣癌組織中PKCε表達水平則較低，強陽性率為0；PKCε在乳腺非特殊型浸潤性癌（χ2=12.628，P=0.002）與微乳頭狀癌（χ2=15.195，P=0.001）組織中的表達但都明顯高于典型髓樣癌。見圖1。

2.2 PKCε在乳腺浸潤性癌中的表達與臨床病理特征的關(guān)系126例乳腺浸潤性癌樣本中，有51例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中33例PKCε過量表達，強陽性率達64.71%，而未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，PKCε強陽性率為41.33%（31/75），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.263，P=0.004）；61例PR陽性的乳腺癌組織中，有35例PKCε過量表達，強陽性率達57.38%，而在65例PR陰性的乳腺癌組織中，有29例PKCε過量表達，強陽性率為44.62%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.262，P=0.016）；組織學分級為2～3級的組織有95例，其中有55例PKCε過量表達，強陽性率達57.90%，而31例乳腺癌組織學分級1級的組織中，PKCε過量表達者9例，強陽性率為29.03%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.853，P=0.02）；此外，26例HER2過表達的乳腺癌組織中，有18例PKCε過量表達，強陽性率為69.23%，而在100例HER2無擴增的乳腺癌中，有46例PKCε過量表達，強陽性率為46.00%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.456，P=0.035），見圖1。但PKCε的過量表達與乳腺癌患者的年齡、癌灶大小、腫瘤的TNM分期、Ki-67的過量表達及ER的表達無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

3 討論

近年來，乳腺癌在全球的發(fā)病率逐年增加［6］，已成為導致全世界女性死亡的重要原因，2015年，我國乳腺癌新發(fā)病達272 000例，因乳腺癌死亡的人數(shù)達70 000例［7］。目前認為，各種原因?qū)е碌募毎g及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導紊亂在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［8］。PKCs作為信號通路中的關(guān)鍵效應分子，與各種腫瘤的發(fā)生、演進、轉(zhuǎn)移及預后的關(guān)系一直是研究的熱點。PKCs是一組絲-蘇氨酸激酶，根據(jù)其包含的部分亞基的結(jié)構(gòu)不同分為 3類：（1）經(jīng)典型 PKC（cPKCs）包括 PKC-α，PKC-βI，PKC-βII和PKC-γ，其活化依賴于Ca離子的結(jié)合，同時也可與DAG結(jié)合而活化；（2）新型PKC（nPKC），包括PKC-δ，PKC-ε、PKC-η和PKC-θ，其活化不依賴于于Ca離子但依賴于DAG；（3）非典型 PKC（aPKC），包括 PKC-ζ和 PKC-ι/λ兩種［9］，其活化既不依賴Ca離子，同時也不依賴DAG。

圖1 PKCε、HER2在不同乳腺組織中的表達Fig.1 The expression of protein kinase C epsilon（PKCε）in different kinds of breast tissue

已有實驗結(jié)果表明PKCε在乳腺癌細胞系中的表達明顯高于其在永生化的正常乳腺細胞系中的表達，表明其在乳腺癌中發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。本研究采用免疫組化方法檢測了PKCε在正常乳腺和乳腺癌中的表達水平。結(jié)果顯示PKCε在乳腺癌中的表達明顯增加，與細胞學實驗的結(jié)果一致［4］，進一步證明PKCε的過量表達與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，PKCε在高級別乳腺浸潤性癌、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌及HER2過表達的乳腺癌中的表達均明顯增加，表明PKCε的過量表達與乳腺癌的不良預后密切相關(guān)。遠處轉(zhuǎn)移是乳腺癌預后差的主要原因，SHAO等［10］發(fā)現(xiàn)敲低乳腺癌細胞中PKCε可降低ezrinT567磷酸化水平，導致乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低，表明PKCε在乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。JAIN等［11］發(fā)現(xiàn)在非致瘤性乳腺上皮細胞MCF-10細胞中過表達PKCε可以誘發(fā)間葉細胞表型，并使其上皮標志物減少，而敲減PKCε可使MCF-10細胞中由TGFβ介導的Snail和間葉細胞減少，表明PKCε是乳腺癌EMT的重要介導因子。

表1 PKCε與浸潤性乳腺癌組織臨床病理學特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between PKCε and clinicopathological features of invasive breast cancer 例

人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor 2，HER-2）蛋白過表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)、不良預后緊密相關(guān)［12］，本組研究中26例HER-2陽性的乳腺癌組織中18例均出現(xiàn)PKCε的過量表達，表明PKCε的過量表達與乳腺癌中HER-2的擴增密切相關(guān)。PAN等［13］使用PKC抑制劑處理HER2擴增性乳腺癌細胞后發(fā)現(xiàn)HER2介導的NF-κB活化降低，表明HER2可通過激活PKC-NF-κB通路促進惡性腫瘤的增殖、凋亡逃逸、遷移和侵襲。HER2擴增性乳腺癌可以通過RictormTORC2信號誘導腫瘤形成、和增加對HER2靶向治療的耐藥性。MORRISON等［14］發(fā)現(xiàn)在HER2擴增性乳腺癌細胞中，PKC a（mTORC2的直接底物）的磷酸化在rictor缺失的細胞中被破壞，表明乳腺癌中HER2-Rictor-mTORC2通路可激活PKC a。PKCε與PKC a同屬PKC家族，它們可能具有相似的功能，且有文獻［15］表明PKCε也可通過促進mTORC2復合物形成，活化AKT（S473），從而激活PI3K-AKT通路，促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移。因此HER-2可能通過HER2-mTORC2-PKC ε通路促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。MAPK/ERK通路是介導細胞外信號向細胞內(nèi)傳到的重要信號傳遞系統(tǒng)，可被多種生長因子和細胞因子磷酸化激活［16］；ERK是調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育的核心信號分子，位于細胞質(zhì)中，可以轉(zhuǎn)移到細胞核，來調(diào)節(jié)HER2與配體結(jié)合，激活蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，使其SH2和SH3區(qū)招募Sos，激活Ras及其下游ERK［17］，從而促進腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，而PKCε可以通過MAPK/ERK通路介導腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移［18］。筆者推測，HER-2和PKCε可能參與這些信號通路相互調(diào)節(jié)，并作用于下游的轉(zhuǎn)錄因子，導致乳腺癌發(fā)生發(fā)展。但HER2是否可以直接磷酸化PKCε使其下游信號通路活化有待進一步研究。

MAO等［19］通過構(gòu)建HER2過表達的ER陰性乳腺癌細胞系SKBR-3和ER陽性的MCF-7細胞系，來評價和比較褪黑激素的抗轉(zhuǎn)移作用，結(jié)果表明褪黑素通過抑制RSK2的表達從而抑制HER2陽性的人類乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。VENTURUTTI等［20］發(fā)現(xiàn)STAT3與Her2啟動子上的反應元件（GAS）結(jié)合，在Her2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌中上調(diào)ErbB-2的轉(zhuǎn)錄。這些研究表明，HER2可以通過RSK2、STAT3等因子發(fā)揮其促進癌細胞轉(zhuǎn)移的作用。而本課題組的其他研究發(fā)現(xiàn)PKCε可通過激活ERKRSK2-STAT3信號通路促進乳腺癌細胞MCF-7的增殖與遷移能力。結(jié)合本研究免疫組化結(jié)果，可以推測HER-2可能通過PKCε-ERK-RSK2-STAT3信號通路發(fā)揮其致癌作用，后續(xù)本課題組可以進一步研究HER-2是否可以直接磷酸化PKCε導致乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，PKCε在乳腺癌組織中表達明顯升高，并且其過量表達與乳腺癌的組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER2的過表達密切相關(guān)，檢測PKCε的表達水平可作為乳腺癌預后判斷的重要指標。腫瘤的發(fā)展是多因素、多步驟參與的過程，因此，乳腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制需要繼續(xù)研究。已有一些研究認為以PKC為治療靶點可能是一種有效的抗癌策略［21］。CAINO等［22］將PKCε選擇性抑制劑肽varepsilonV1-2應用于患有小鼠身上，發(fā)現(xiàn)可以減少非小細胞肺癌的異位移植，且PKCε的RNA干擾耗竭和藥理抑制均導致NSCLC腫瘤凋亡細胞數(shù)量顯著升高。因此，靶向抑制PKCε或其在腫瘤中上調(diào)的機制可能為PKCε過表達所致乳腺癌的治療提供新的方法。