楊金月，張 濤，常 明，劉睿杰，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

秀麗隱桿線蟲(秀麗線蟲)是小型土壤線蟲，其脂肪顆粒主要存儲(chǔ)于腸道及皮下細(xì)胞，身體透明便于脂滴的觀察[1]；秀麗隱桿線蟲脂肪顆粒的標(biāo)記方法簡單，利用油紅O和尼羅紅等染料都可以使秀麗隱桿線蟲脂肪著色[2]。此外，秀麗隱桿線蟲脂肪酸的合成、降解代謝與人體高度相似，參與脂肪代謝關(guān)鍵步驟的限速酶與哺乳動(dòng)物基本相同[3]。因此，秀麗隱桿線蟲是理想的脂質(zhì)代謝研究模型。

由于秀麗隱桿線蟲水溶性的培養(yǎng)條件使得利用秀麗隱桿線蟲評價(jià)非水溶性物質(zhì)的功效受到限制。目前，利用秀麗隱桿線蟲評價(jià)脂溶性物質(zhì)的方法有助溶劑法(二甲基亞砜、乙醇)[4]、顯微注射法[5]和包埋法[6]。由于食用油的疏水性，二甲基亞砜和乙醇的效果不佳。顯微注射技術(shù)操作復(fù)雜，對秀麗隱桿線蟲易造成損傷。包埋是一種常用的改善脂溶性成分的水相遞送的方式，在食品、飲料、農(nóng)業(yè)、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域等應(yīng)用廣泛[7]。目前已有利用吐溫作為乳化劑[6]喂食秀麗隱桿線蟲甘三酯的報(bào)道。吐溫是山梨酸醇脂肪酸酯類乳化劑，使用吐溫作為乳化劑將脂肪酸引入秀麗隱桿線蟲體內(nèi)，乳化劑里的脂肪酸在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)代謝，利用秀麗隱桿線蟲評價(jià)包埋的甘三酯在體內(nèi)的代謝時(shí)，很難與乳化劑里的脂肪酸對脂質(zhì)代謝的影響區(qū)分開。

白蛋白是一種具有生物親和性的大分子乳化劑，是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，具有高溶解度和穩(wěn)定性，其純度高、成本低，在乳液傳遞系統(tǒng)中應(yīng)用廣泛。白蛋白乳液作為藥物的載體可以有效地提高藥物的療效并降低毒副作用，增加藥物溶解度，顯著提高生物利用度[8]。Tang等[9]研究表明，白蛋白具有良好的乳化性能，其乳化能力優(yōu)于大豆蛋白、酪蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用白蛋白作為乳化劑，建立秀麗隱桿線蟲油脂評價(jià)模型。通過熒光標(biāo)記和線蟲脂肪酸組成分析驗(yàn)證蛋白乳液是否將甘三酯導(dǎo)入秀麗隱桿線蟲。研究乳液粒徑和油脂濃度對秀麗隱桿線蟲攝入的影響。通過秀麗隱桿線蟲油脂評價(jià)模型的建立，為食用油脂的營養(yǎng)評價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型秀麗隱桿線蟲和大腸桿菌OP50由江蘇大學(xué)贈(zèng)送。白蛋白，化學(xué)純，北京索萊寶科技有限公司；中碳鏈甘三酯(MCT)，上海佑創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司；共軛亞油酸甘三酯(CLA-TG)，購自當(dāng)?shù)爻校荒崃_紅、油紅O、熒光素異硫氰酸酯(FITC)，美國Sigma公司；正己烷，色譜純，上海國藥集團(tuán)；甲醇、硫酸、氫氧化鉀、三亞油酸甘油酯(LA-TG)等，均為分析純；甘油三酯(TG)檢測試劑盒，南京建成有限責(zé)任公司；BCA蛋白濃度測試試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

Ultra-Turrax T25高速分散機(jī)，德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；GEA Niro高壓均質(zhì)機(jī)，意大利GEA Niro Soavi公司；Axio Vert A1倒置熒光顯微鏡，德國卡爾蔡司公司；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；M5酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；ZHJH-112B超凈工作臺(tái)；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器；EL204電子分析天平；TDL-50C低速臺(tái)式離心機(jī)；GC-14 B氣相色譜儀，配備火焰離子化檢測器(FID)，日本Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[10]。秀麗隱桿線蟲采用液態(tài)培養(yǎng)基，為防止大腸桿菌攝入乳液對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，在實(shí)驗(yàn)過程中大腸桿菌OP50均在60℃放置1 h殺死。喂食乳液前秀麗隱桿線蟲經(jīng)過次氯酸鈉和氫氧化鈉同期化處理，使得秀麗隱桿線蟲處于同一生長周期。

1.2.2 乳液的制備

乳液制備方法在Lu等[11]方法基礎(chǔ)上稍加修改。以白蛋白為乳化劑，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白質(zhì)溶液，攪拌2 h，4℃放置過夜使其充分水化。蛋白質(zhì)溶液和MCT混合(MCT含量10%)，20 000 r/min高速剪切2 min，制得粗乳液，高壓均質(zhì)制得乳液，均質(zhì)壓力10～90 MPa，均質(zhì)1～3次。新鮮乳液的平均粒徑和粒徑分布采用Zetasizer Nano-ZS90粒度分析儀進(jìn)行測定，并以蒸餾水溶液作為分散介質(zhì)稀釋1 000倍，設(shè)置參數(shù)顆粒折射率為1.456，連續(xù)相的折射率為1.330。

1.2.3 顯微鏡觀察

乳液中蛋白和油相的染色方法分別參照Yin[12]、Colmenares[6]等的方法，使用FITC標(biāo)記白蛋白，尼羅紅標(biāo)記MCT。秀麗隱桿線蟲的油紅O染色參照Ashrafi等[13]的方法。

1.2.4 秀麗隱桿線蟲喂食乳液

同期化秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至液態(tài)培養(yǎng)基中，每毫升培養(yǎng)基中含有100條秀麗隱桿線蟲，加入殺死的大腸桿菌OP50，加入不同粒徑(200、300、400 nm)和不同MCT濃度(0.01、0.1、1、10 mmol/L)的乳液，20℃培養(yǎng)50 h。

1.2.5 秀麗隱桿線蟲脂肪酸組成測定

秀麗隱桿線蟲脂肪酸組成的測定方法參照Watts等[14]的方法并稍作修改。用去離子水將秀麗隱桿線蟲沖洗3遍，離心棄上清。將秀麗隱桿線蟲移至具塞玻璃離心管中，加入1 mL 2.5%硫酸甲醇，80℃水浴振蕩1 h。加入200 μL正己烷和1 mL超純水，5 000 r/min離心1 min，取上層用GC進(jìn)行分析。

氣相色譜條件：氮?dú)鉃檩d氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比1∶20，進(jìn)樣量1.0 μL，升溫程序?yàn)?0℃保持3 min，5℃/min升至170℃，保持15 min，2℃/min升至220℃，保持10 min。以峰面積占比定量，保留時(shí)間定性。

1.2.6 秀麗隱桿線蟲甘三酯消化吸收的測定

按照1.2.2方法制備CLA-TG和LA-TG蛋白乳液，乳液平均粒徑為(200±20)nm。按照1.2.4方法將乳液喂食給秀麗隱桿線蟲。采用甘油三酯試劑盒測定秀麗隱桿線蟲甘三酯含量，用蛋白質(zhì)定量，蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒。

1.2.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用One-Way ANOVA方差分析。P<0.05，差異具有顯著性；P<0.01，差異具有極顯著性。數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳液的特征

按1.2.2方法制備乳液，研究均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對平均粒徑的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對平均粒徑的影響

由圖1可知，均質(zhì)1次時(shí)，均質(zhì)壓力從10 MPa增加到90 MPa，平均粒徑逐漸減小。均質(zhì)壓力為10 MPa時(shí)，均質(zhì)1、2、3次的平均粒徑分別為(458.93±10.18)、(345.34±10.18)、(280.50±12.88)nm。均質(zhì)壓力為90 MPa時(shí)，均質(zhì)1、2、3次的平均粒徑分別為(165.56±11.17)、(150.88±9.01)、(148.81±10.23)nm。當(dāng)均質(zhì)壓力小于70 MPa時(shí)，隨均質(zhì)次數(shù)的增加平均粒徑減小；當(dāng)均質(zhì)壓力大于70 MPa時(shí)，均質(zhì)次數(shù)對平均粒徑的影響不大。這種變化可能是因?yàn)楫?dāng)均質(zhì)壓力大于70 MPa，乳液在均質(zhì)1次時(shí)已達(dá)到較小粒徑，再次提供能量使得乳液平衡發(fā)生改變，過小粒徑的乳液會(huì)再次發(fā)生聚集，達(dá)到粒徑平衡狀態(tài)，所以再次均質(zhì)時(shí)乳液粒徑不會(huì)繼續(xù)減小。在本實(shí)驗(yàn)條件下，所能制得的乳液最小粒徑為(148.81±10.23)nm?？紤]到過小顆?？赡墚a(chǎn)生的納米毒性[15]和大顆粒乳液穩(wěn)定性差[11]等因素，本實(shí)驗(yàn)研究不同乳液粒徑對其攝入的影響時(shí)選擇平均粒徑為(200±20)、(300±20)、(400±20)nm的3種乳液，粒徑分散系數(shù)小于0.2。圖2為3種乳液粒徑分布圖。

圖2 3種乳液粒徑分布圖

從圖2可以看出，3種乳液粒徑分布均符合正態(tài)分布，分布均勻。

2.2 乳液攝入顯微鏡觀察(見圖3)

圖3 乳液熒光染色圖片(a)和秀麗隱桿線蟲喂食染色乳液的熒光圖片(b)

從圖3可以看出，白蛋白制備的乳液為單層結(jié)構(gòu)，外層的白蛋白(蛋白被FITC染成綠色)和內(nèi)部的MCT(MCT被尼羅紅染成紅色)，將FITC和尼羅紅熒光染色的乳液喂食秀麗隱桿線蟲，發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲具有綠色和紅色熒光，說明秀麗隱桿線蟲成功攝入蛋白乳液。秀麗隱桿線蟲全身呈現(xiàn)紅色熒光，而只有腸腔呈現(xiàn)綠色熒光，分析原因可能是由于尼羅紅作為脂溶性染料具有很強(qiáng)的標(biāo)記能力，在喂食熒光標(biāo)記的乳液過程中乳液中的尼羅紅將秀麗隱桿線蟲本身的脂質(zhì)標(biāo)記，使得秀麗隱桿線蟲通體呈現(xiàn)紅色熒光，而FITC只標(biāo)記乳液中的蛋白，乳液被秀麗隱桿線蟲攝食后進(jìn)入腸腔，因此在腸腔觀察到綠色熒光。

2.3 影響乳液攝入的因素

粒徑和甘三酯濃度是影響乳液攝入率的兩大因素，實(shí)驗(yàn)選擇MCT作為油相研究了秀麗隱桿線蟲攝入不同粒徑和不同MCT濃度的乳液后的脂肪酸組成，結(jié)果如表1所示。

表1 喂食不同粒徑乳液秀麗線蟲脂肪酸組成及含量

注：乳液中MCT濃度為1 mmol/L。

從表1可以看出，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)出現(xiàn)原來不存在的辛酸(C8∶0)和癸酸(C10∶0)，證明秀麗隱桿線蟲可以攝入乳液中的MCT。攝入400、300、200 nm粒徑的MCT乳液秀麗隱桿線蟲體內(nèi)積累的辛酸(C8∶0)含量分別為5.63%、9.61%、10.9%，癸酸(C10∶0)含量分別為9.90%、16.27%、20.38%。數(shù)據(jù)顯示在實(shí)驗(yàn)粒徑條件下秀麗隱桿線蟲均能攝入乳液，粒徑越小越有利于秀麗隱桿線蟲攝入。Colmenares等[6]研究發(fā)現(xiàn)使用吐溫型水包油乳液來傳遞親脂性化合物，秀麗隱桿線蟲可以攝取40～500 nm的乳液，特別是300～500 nm的大粒徑乳液。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。分析原因，可能是由于實(shí)驗(yàn)中不同的培養(yǎng)環(huán)境。Colmenares等[6]使用固體瓊脂培養(yǎng)皿，小粒徑乳液可能滲入瓊脂內(nèi)部，而秀麗隱桿線蟲更容易攝入瓊脂表面的大乳液，采用液態(tài)培養(yǎng)基時(shí)，小顆粒乳液更易隨液態(tài)培養(yǎng)基被秀麗隱桿線蟲攝入。

選用吸收最好的200 nm粒徑組為實(shí)驗(yàn)組研究MCT濃度對秀麗隱桿線蟲攝入的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 MCT濃度對秀麗隱桿線蟲脂肪酸組成的影響

由表2可以看出，粒徑為200 nm時(shí)，攝入濃度分別為0.01、0.1、1、10 mmol/L MCT乳液的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)積累的辛酸(C8∶0)含量分別為0.42%、4.36%、9.50%、12.88%，癸酸(C10∶0)含量分別為0.47%、8.63%、20.38%、24.82%。因此，在0.01～10 mmol/L范圍內(nèi)秀麗隱桿線蟲均能攝入乳液，隨著MCT濃度增加秀麗隱桿線蟲攝入乳液的量增加。

2.4 乳液的消化吸收

脂肪酸分析和熒光標(biāo)記說明秀麗隱桿線蟲可以攝入乳液中的MCT，但是否能消化利用MCT需要進(jìn)一步驗(yàn)證。已有研究報(bào)道CLA-TG具有降低秀麗隱桿線蟲體脂的生物活性，LA-TG雖然結(jié)構(gòu)和CLA-TG相似卻不具有該功效[16]。為進(jìn)一步證實(shí)秀麗隱桿線蟲可以生物利用乳液中的MCT，檢測喂食CLA-TG乳液后秀麗隱桿線蟲的TG含量，以喂食LA-TG乳液作為對照組，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)濃度為0.1 mmol/L時(shí)，CLA-TG組秀麗隱桿線蟲的TG含量((0.116±0.001 41)mmol/mg)顯著低于LA-TG組((0.174±0.006 57)mmol/mg)(P<0.05)。說明該濃度下CLA-TG被秀麗隱桿線蟲利用，從而降低秀麗隱桿線蟲體脂。當(dāng)濃度為0.01 mmol/L和1 mmol/L時(shí)，LA-TG組和CLA-TG組線蟲TG含量無顯著變化。分析可能原因，當(dāng)TG濃度為0.01 mmol/L時(shí)，秀麗隱桿線蟲攝入CLA-TG未達(dá)到發(fā)揮生理功效的有效劑量；當(dāng)TG濃度為1 mmol/L時(shí)，秀麗隱桿線蟲攝入CLA-TG過多，大量CLA-TG在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)積累造成TG增加。本實(shí)驗(yàn)表明，TG在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)揮功效是與其濃度相關(guān)的。后續(xù)使用秀麗隱桿線蟲評價(jià)油脂營養(yǎng)時(shí)，選擇合適的TG濃度至關(guān)重要。

圖4 秀麗隱桿線蟲喂食CLA-TG和LA-TG乳液后TG含量變化

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立利用白蛋白乳液喂食秀麗隱桿線蟲甘三酯的方法。采用高壓均質(zhì)的方法制備平均粒徑200～400 nm的蛋白乳液。通過脂肪酸分析和熒光標(biāo)記觀察驗(yàn)證秀麗隱桿線蟲可以攝入乳液。當(dāng)乳液的平均粒徑在200～400 nm范圍時(shí)，粒徑越小越有利于秀麗隱桿線蟲攝入油脂；當(dāng)培養(yǎng)基中MCT濃度在0.01～10 mmol/L范圍時(shí)，濃度越高越有利于秀麗隱桿線蟲攝入油脂。此外，本文還利用共軛亞油酸甘油三酯進(jìn)行了方法驗(yàn)證，結(jié)果顯示乳液遞送的共軛亞油酸甘油三酯被秀麗隱桿線蟲成功代謝，減少了體內(nèi)脂肪的積累，證實(shí)了乳液中的甘三酯可以被消化吸收。白蛋白乳液傳遞系統(tǒng)操作簡單，白蛋白作為乳化劑穩(wěn)定、生物親和性好。本實(shí)驗(yàn)為利用秀麗隱桿線蟲研究甘三酯及伴隨物等非水溶性物質(zhì)提供方法，拓寬了秀麗隱桿線蟲作為體外模型的應(yīng)用。