耿樹(shù)香，寧德魯，李勇杰，陳海云

(云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650201)

油橄欖是世界著名的優(yōu)質(zhì)木本油料樹(shù)種，是木犀科木犀欖屬的小喬木。栽培油橄欖OleaeuropaeaL.是從野生種OleachrysophyllaLam.經(jīng)過(guò)OleaoleasterL.或Oleaeuropaeaoleaster進(jìn)化而來(lái)的。橄欖油是油橄欖中最有價(jià)值的部分，其富含不飽和脂肪酸及維生素、類胡蘿卜素、多酚類化合物和有機(jī)酸等[1-2]。目前，國(guó)外對(duì)油橄欖基因組方面的研究做了很多工作[3-10]。如對(duì)油橄欖栽培種萊星進(jìn)行測(cè)序、組裝，獲得完整基因組；對(duì)油橄欖栽培種Farga使用RNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，產(chǎn)生了56 000多個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序、組裝，獲得完整基因組；研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合siRNA中的一個(gè)油橄欖OD基因隨其積累可導(dǎo)致FAD2不表達(dá)，抑制FAD2基因表達(dá)的結(jié)果是可導(dǎo)致油橄欖果中油酸含量增高。國(guó)內(nèi)近年來(lái)對(duì)木本油料油脂合成代謝途徑的轉(zhuǎn)錄組基因組學(xué)研究越來(lái)越多[11]，如林萍[12]、Xia[13]等對(duì)普通油茶種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，陳昊等[14]對(duì)油桐種子3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，丁健[15]對(duì)沙棘果油脂積累轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。目前，對(duì)影響油橄欖油脂合成的關(guān)鍵基因及途徑尚未清晰，特別是油橄欖果中髙積累油酸的機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)油橄欖果油脂和脂肪酸組分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及發(fā)育過(guò)程中相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式進(jìn)行研究，可為通過(guò)現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)探索油橄欖油脂合成積累機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步提高油橄欖油脂含量提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以云南永仁引種油橄欖佛奧(FA)及鄂植8號(hào)(EZ)品種為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，取2個(gè)油橄欖品種授粉后60 d(5月)、120 d(7月)、180 d(9月)，分別在所選油橄欖品種株樣樹(shù)冠中部的東、西、南、北4個(gè)方位隨機(jī)采摘果實(shí)10個(gè)，立即置于液氮中，于-80℃冰箱保存，備用。

重蒸水；CTAB、水飽和酚、三氯甲烷、異戊醇、無(wú)水乙醇，分析純；安捷倫RNA提取試劑盒、TruSeq RNA樣品準(zhǔn)備試劑盒，美國(guó)Illumina公司；超級(jí)II逆轉(zhuǎn)錄酶，美國(guó)Invitrogen公司；AgencourtAMPure XP-Medium，美國(guó)Agencourt公司；TaKaRa Ex Taq Hot Start版、HiSeq 4000 SBS工具包、HiSeq 4000 PE Cluster Kit，美國(guó)Illumina公司。

熒光定量PCR儀，瑞士Roche；冷凍混合球球磨儀，德國(guó)萊馳；日本奧林巴斯顯微成像系統(tǒng)；Nano drop 2000超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；Illumina genome Analyzer測(cè)序儀、Cluster generation、HiSeq System，美國(guó)Illumina公司；Agilent 2100 Bioanalyzer，美國(guó)安捷倫公司；Eppendorf高速低溫離心機(jī)、全套Eppendorf微量移液器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油橄欖果實(shí)RNA的提取

油橄欖果實(shí)RNA的提取方法按照TIANGEN?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

油橄欖佛奧(FA)及鄂植8號(hào)(EZ)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由成都生命基線科技有限公司完成。提取的樣品總RNA用DNasel消化基因組DNA，經(jīng)質(zhì)檢合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑在恒溫混勻儀中將mRNA打斷成150～200 nt的短片段，以短片段mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA；然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并利用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化后的cDNA先進(jìn)行黏性末端修復(fù)，隨后在cDNA的3′末端加上堿基A并連接接頭，最后進(jìn)行片段大小選擇和PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR Syst實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)質(zhì)檢合格后，進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾和數(shù)據(jù)質(zhì)控后得到高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，使用HISAT2軟件將高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因/基因組序列后，統(tǒng)計(jì)其在二者上的分布情況，比對(duì)質(zhì)控合格后才能進(jìn)行定量分析、功能富集分析、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄組本預(yù)測(cè)及注釋、SNP/InDel檢測(cè)和基因融合等后續(xù)一系列分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋和表達(dá)分析

參考油橄欖基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋?；虮磉_(dá)量的計(jì)算采用FPKM(Fragments per Kilobase Million)，即每100萬(wàn)個(gè)比對(duì)上的測(cè)序序列到外顯子的每1 000個(gè)堿基上的可讀序列個(gè)數(shù)。在RNA-Seq分析中，可通過(guò)對(duì)測(cè)序序列的計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)基因的表達(dá)水平。一個(gè)基因表達(dá)水平的直接體現(xiàn)就是其兩端不能再延長(zhǎng)的序列的豐度情況，兩端不能再延長(zhǎng)的序列豐度程度越高，則基因表達(dá)水平越高。Reads計(jì)數(shù)除了與基因的真實(shí)表達(dá)水平成正比外，還與基因的長(zhǎng)度和測(cè)序深度呈正相關(guān)。

1.2.4 差異基因表達(dá)分析

差異基因表主要用于考察各發(fā)育階段間的基因表達(dá)差異，主要參照Audic法。在得到差異檢驗(yàn)的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)值的同時(shí)，根據(jù)基因的表達(dá)量(FPKM)計(jì)算該基因2個(gè)樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，則表示表達(dá)差異越顯著。在本研究數(shù)據(jù)分析中，將基因表達(dá)矩陣分為隨機(jī)組和對(duì)照組，使用DEGSeq軟件對(duì)差異基因表達(dá)進(jìn)行分析，對(duì)差異檢驗(yàn)的概率作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制FDR來(lái)決定概率的域值，分析中取p不大于0.05為篩選差異基因的閾值。

1.2.5 差異基因表達(dá)Pathway及GO分析

以油橄欖基因組數(shù)據(jù)為參考基因進(jìn)行構(gòu)建人工比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，以佛奧和鄂植8號(hào)測(cè)得的具有編碼蛋白序列的289、593、580個(gè)兩端不能再延長(zhǎng)的序列基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能注釋，并運(yùn)用人工比對(duì)進(jìn)行功能分類。Pathway分析同時(shí)還借助GO和MapMan(3.5.1R2)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種油橄欖品種的含油率

佛奧(FA)和鄂植8號(hào)(EZ)的鮮果在不同的成熟時(shí)期果實(shí)的形態(tài)差異明顯，參照GB/T 14772—2008中提油方法，對(duì)佛奧和鄂植8號(hào)的鮮果在果實(shí)成熟階段的60 d(5月)、120 d(7月)、180 d(9月)對(duì)鮮果含油率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，佛奧的含油率顯著高于鄂植8號(hào)。伴隨著果實(shí)成熟，果實(shí)顏色逐漸變黑，2個(gè)油橄欖品種含油率顯著增加，呈上升趨勢(shì)。因此，本研究選取成熟過(guò)程中的佛奧和鄂植8號(hào)的鮮果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究參與油橄欖脂肪酸代謝途徑的表達(dá)差異基因，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析解析2個(gè)品種間含油率差異的原因。

圖1 佛奧(FA)與鄂植8號(hào)(EZ)油橄欖鮮果含油率

2.2 RNA質(zhì)量及濃度檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)，提取2個(gè)品種3個(gè)時(shí)期油橄欖鮮果的RNA樣品28S∶18S值均在0.5～1.3間，反應(yīng)RNA完整性的RIN值大于7.5，初提質(zhì)量良好，符合進(jìn)一步檢測(cè)并測(cè)序的要求。濃度和純度檢測(cè)結(jié)果顯示大部分樣本RNA提取完整性好，無(wú)降解，無(wú)蛋白、多糖、多酚和DNA等雜質(zhì)污染，完全達(dá)到文庫(kù)構(gòu)建要求(RIN值>7)。

2.3 Illumina雙末端測(cè)序以及denovo組裝(見(jiàn)表1)

表1 油橄欖成熟過(guò)程中果實(shí)轉(zhuǎn)錄組基本數(shù)據(jù)

由表1可知，通過(guò)Illumina測(cè)序，F(xiàn)A5得到46 764 072條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，F(xiàn)A7得到49 780 566條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，F(xiàn)A9得到49 689 152條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，EZ5得到46 646 112條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，EZ7得到49 435 120條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，EZ9得到47 278 558條高質(zhì)量序列數(shù)據(jù),平均長(zhǎng)度在327 bp。將2個(gè)品種的成熟過(guò)程中的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)比對(duì)到油橄欖基因組，F(xiàn)A5、FA7、FA9、EZ5、EZ7、EZ9基因組分別達(dá)到55.48%、55.86%、45.43%、55.39%、54.79%、58.22%的匹配，所比對(duì)到的表達(dá)基因分別為26 231、26 079、25 292、27 255、25 994、25 344個(gè)，所比對(duì)的測(cè)序所得序列與基因序列達(dá)到35.29%、37.99%、27.13%、34.41%、35.71%、37.32%的匹配。兩端不能再延長(zhǎng)的序列長(zhǎng)度在200 bp以上。

2.4 差異基因表達(dá)分析(見(jiàn)圖2)

注：A、B、C、D、E、F分別為FA7-vs-FA5、FA9-vs-FA7、FA9-vs-FA5、EZ7-vs-EZ5、EZ9-vs-EZ7、EZ9-vs-EZ5。

圖2 油橄欖成熟過(guò)程中果實(shí)差異基因統(tǒng)計(jì)

從圖2可以看出，佛奧的不同月份發(fā)育時(shí)期之間差異基因的表達(dá)(上調(diào)或下調(diào))變化不明顯，而鄂植8號(hào)5月與7月、5月與9月的差異基因的表達(dá)差異較大，下調(diào)的基因數(shù)量是上調(diào)基因數(shù)量的兩倍，推測(cè)可能與果實(shí)的成熟和發(fā)育相關(guān)。顎植8號(hào)油橄欖品種在果實(shí)成熟初期及末期差異基因數(shù)較多，說(shuō)明其成熟前后，差異基因表達(dá)較多，這與果實(shí)成熟規(guī)律趨于一致，即果實(shí)成熟初期，細(xì)胞分裂旺盛，內(nèi)含物質(zhì)新陳代謝旺盛，而發(fā)育后期，油脂累積趨于穩(wěn)定所致。

2.5 油橄欖油脂生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)(見(jiàn)表2)

表2 油橄欖油脂生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)

從表2可以看出：橄欖油生物合成途徑中第一步的關(guān)鍵酶是生物素羧基載體蛋白(Biotin carboxyl carrier proteins，BCCP)，EZ7的基因表達(dá)最高，F(xiàn)PKM為3 338.30，F(xiàn)A5最低，F(xiàn)PKM為482.96，F(xiàn)A7為FA中表達(dá)量最高的，F(xiàn)PKM為2 351.68；第二步反應(yīng)中的β-酮酰基ACP還原酶(Beta-ketoacyl-ACP reductase，F(xiàn)ABG)基因表達(dá)量最高的是EZ7，F(xiàn)PKM為3 063.45，F(xiàn)A5最低，F(xiàn)PKM為811.36，F(xiàn)A7為FA中表達(dá)量最高的，F(xiàn)PKM為2 494.31；β-羥酰ACP脫氫酶(Beta-hydroxyacyl-ACP dehydrases，F(xiàn)ABZ)基因表達(dá)量最高的是EZ7，F(xiàn)PKM為2 708.94，F(xiàn)A5最低，F(xiàn)PKM為657.02，F(xiàn)A7為FA中表達(dá)量最高的，F(xiàn)PKM為1 547.22。在油橄欖的整個(gè)成熟期，兩品種油橄欖果實(shí)在7月脂肪酸的生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量最高。

脂肪酸去飽和酶有許多種，可以將其分為兩大類，一類在脂肪酸形成甘油酯之前引入第一個(gè)雙鍵時(shí)起作用，僅包含一種酶，即硬脂酰ACP去飽和酶(stearoyl-ACP desaturase，SACPD)，主要存在于質(zhì)體中，是唯一的一種可溶性去飽和酶，另外一類是形成甘油酯之后，在脂肪酸基團(tuán)進(jìn)一步去飽和過(guò)程中起作用，包括油酸去飽和酶(FAD2-4和FAD2-5)和亞油酸去飽和酶(FAD3-3)。

油橄欖不飽和脂肪酸形成相關(guān)酶中omega-6油酸去飽和酶(FAD2)基因表達(dá)量最高的是FA5，F(xiàn)PKM為415.47，F(xiàn)A7基因表達(dá)量最低，為70.12，EZ5為EZ中表達(dá)量最高的，F(xiàn)PKM為366.46，兩品種均為5月樣品具有高表達(dá)量的FAD2。油橄欖果中的β-酮酰基ACP合成酶(Beta-ketoacyl-ACP synthases，KAS)中的KASI基因是啟動(dòng)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，在鄂植8號(hào)果實(shí)的3個(gè)發(fā)育時(shí)期，隨油橄欖成熟度增加，油橄欖果中的KAS基因的表達(dá)水平不斷增加，EZ5中FPKM為227.66，EZ9為416.10，KAS基因的表達(dá)水平影響橄欖油中脂肪酸的合成。

2.6 油脂合成基因的表達(dá)分析(見(jiàn)表3)

表3 2個(gè)品種不同發(fā)育相鄰時(shí)期脂肪酸合成與降解差異基因表達(dá)

在6個(gè)油橄欖樣本中總共檢測(cè)出1 886個(gè)基因具有表達(dá)。由表3可知：佛奧果實(shí)FA5-vs-FA7發(fā)育時(shí)期，脂肪酸合成路徑乙酰輔酶A合成丙二酰輔酶A，1個(gè)基因發(fā)生了上調(diào)表達(dá),而在脂肪酸降解途徑中有4個(gè)基因發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因發(fā)生了下調(diào)表達(dá)；FA7-vs-FA9時(shí)期,脂肪酸合成途徑上有1個(gè)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，沒(méi)有注釋到上調(diào)表達(dá)的候選基因，脂肪酸降解途徑發(fā)生了1個(gè)基因的下調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)；FA5-vs-FA9時(shí)期，脂肪酸合成路徑上被注釋到的基因有2個(gè)發(fā)生了下調(diào)表達(dá)，而沒(méi)有上調(diào)表達(dá)的基因，脂肪酸降解途徑被注釋到的基因有5個(gè)發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，有4個(gè)發(fā)生了下調(diào)表達(dá)；鄂植8號(hào)果實(shí)EZ5-vs-EZ7時(shí)期,在脂肪酸合成路徑上被注釋到的基因有3個(gè)發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，有3個(gè)發(fā)生了下調(diào)表達(dá)，脂肪酸降解途徑上被注釋到的基因有3個(gè)發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，有5個(gè)發(fā)生了下調(diào)表達(dá)；EZ7-vs-EZ9時(shí)期,脂肪酸合成路徑上注釋到的基因有1個(gè)發(fā)生了上調(diào)，沒(méi)有注釋到下調(diào)基因，脂肪酸降解途徑上注釋到的基因有3個(gè)發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，有3個(gè)發(fā)生了下調(diào)表達(dá)；EZ5-vs-EZ9時(shí)期，脂肪酸合成路徑上注釋到的基因有4個(gè)發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，有2個(gè)基因發(fā)生了下調(diào)表達(dá)，脂肪酸降解途徑上注釋到的基因有6個(gè)發(fā)生上調(diào)表達(dá)，有7個(gè)發(fā)生下調(diào)表達(dá)。

2.7 油脂合成基因的聚類分析

根據(jù)差異基因檢測(cè)結(jié)果，使用gplots軟件包進(jìn)行層次聚類分析。對(duì)1 886個(gè)基因進(jìn)行篩選，將FPKM 值低于200的差異基因去除，對(duì)篩選后的208個(gè)與油脂合成相關(guān)的基因采用Omicshare在線工具(http://www.omicshare.com)作圖并進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 油橄欖果與油脂合成相關(guān)基因聚類分析

從圖3可以看出，2個(gè)品種油橄欖參與油脂合成的差異基因表達(dá)模式在5月較為相似，每個(gè)品種的7月和9月差異基因的表達(dá)模式較為相似，果實(shí)成熟后期(7月和9月)與果實(shí)生長(zhǎng)初期(5月)相比，大多數(shù)基因發(fā)生了表達(dá)量上調(diào)，可能與果實(shí)的成熟有關(guān)。

為尋找脂肪合成的相關(guān)基因，以脂肪合成初期(FA5)與合成盛期(FA9)的表達(dá)譜比對(duì)，分析比對(duì)脂肪酸合成通路的差異基因，包括脂肪酸合成通路、脂肪酸鏈延伸通路以及不飽和脂肪酸的合成通路等。結(jié)果顯示：在脂肪合成盛期上調(diào)表達(dá)的基因均為與橄欖油脂肪酸合成相關(guān)的基因，有β-酮?；鵄CP合成酶、硬脂酰ACP去飽和酶(SACPD)等。

3 結(jié) 論

(1)以含油率差異顯著的2個(gè)品種(高含油率品種佛奧(FA)，9月油橄欖果含油率為23.16%和低含油率品種鄂植8號(hào)(EZ)，9月含油率為15.17%)為材料，轉(zhuǎn)錄組分析探究了其果實(shí)發(fā)育3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期(5月、7月和9月)基因表達(dá)與油脂積累的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，在FA7-vs-FA5、FA9-vs-FA7、FA9-vs-FA5、EZ7-vs-EZ5、EZ9-vs-EZ7、EZ9-vs-EZ5 6個(gè)階段中分別找到783、634、1 518、716、486和1 017個(gè)差異基因上調(diào)，662、614、1 467、1 478、594和2 210個(gè)差異基因下調(diào)。

(2)在脂肪酸代謝途徑中富集到的KAS、FAD、BCCP、FABG、EAR等基因可能是油橄欖果油脂和脂肪酸生物合成關(guān)鍵基因，其后續(xù)通過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和蛋白異源表達(dá)等對(duì)基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步闡明油橄欖果油脂合成途徑及其關(guān)鍵酶的功能，揭示油橄欖果油脂合成的分子機(jī)理，進(jìn)而為建立油橄欖果油脂異源合成系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)，而不同時(shí)期油橄欖果差異基因表達(dá)的掌握對(duì)研究不同組織中生物活性成分的品質(zhì)形成機(jī)制具有重要作用。

(3)脂肪酸合成、甘油酯代謝和甘油磷脂代謝等途徑是影響油橄欖油脂合成的關(guān)鍵途徑，在FA-vs-EZ的脂類代謝途徑中，僅有脂肪酸生物合成途徑中的差異基因表達(dá)呈顯著富集，表明油橄欖果油脂在從頭合成中即產(chǎn)生明顯差異，油橄欖果中與脂肪酸合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)水平均隨果實(shí)成熟度的增加呈上升趨勢(shì)。