劉旭昊，祖恩普，王 凡

（洛陽師范學(xué)院，河南 洛陽 471000）

三氯生（Triclosan，TCS）化學(xué)名稱為2,4,4′-三氯-2′-羥基二苯醚，微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑和堿液。為廣譜抗菌劑和殺菌劑，廣泛應(yīng)用于肥皂、牙膏、化妝品等個(gè)人護(hù)理品，醫(yī)療殺菌劑等醫(yī)療用品，纖維產(chǎn)品、絲質(zhì)產(chǎn)品等紡織用品中。隨著日用消費(fèi)品的大量使用，TCS 廣泛存在于自然界中，現(xiàn)已于污水處理廠、污泥、河口、河流等檢測(cè)到TCS，在污水處理廠進(jìn)、出水濃度分別高達(dá)86.2、2.7 μg/L，自然河流和沉積物中分別高達(dá)2.3、2.7 μg/kg[1]。由于TCS 具有一定的穩(wěn)定性、生物蓄積性和弱毒性等特點(diǎn)，其潛在威脅已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究焦點(diǎn)之一[1-4]。目前，關(guān)于TCS 毒理學(xué)研究已有大量報(bào)道，李林朋等[5]在TCS 對(duì)人體肝細(xì)胞DNA 損傷研究中證實(shí)，低濃度TCS 會(huì)導(dǎo)致DNA 損傷。鄭欣等[6]研究表明，TCS 會(huì)導(dǎo)致生物體組織發(fā)生突變和癌變，并對(duì)生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)有干擾性。陳建軍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TCS 對(duì)硬骨魚類有潛在遺傳毒性和生理毒性。迄今，關(guān)于TCS 對(duì)鯉科魚類肝胰臟細(xì)胞凋亡影響的研究報(bào)道較少。

斑馬魚（Danio rerio）為一種常見的模式生物，廣泛用于遺傳、藥理學(xué)、毒理學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的研究[8-9]。肝臟是魚類的重要代謝器官和解毒器官，可在魚類早期發(fā)育過程中降低外來毒物的毒性效應(yīng)[10]。本研究以斑馬魚為材料研究TCS 對(duì)雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，有助于揭示TCS 對(duì)硬骨魚類肝胰臟損傷的相關(guān)分子機(jī)制，為水體中TCS 的污染管控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚購(gòu)于上海誠(chéng)信漁場(chǎng)，體長(zhǎng)1.5～2.1 cm。將斑馬魚放在60 L 水族箱中馴養(yǎng)，不間斷充氧（DO ＞ 5 mg/L），每天早晚各投食1 次，并定時(shí)清理食物殘?jiān)汪~的排泄物，每天換水1 次，換水量為1/2，馴養(yǎng)用水為曝氣72 h 的自來水。水溫(22±3) ℃，pH 6.8±0.2。整個(gè)馴養(yǎng)期間斑馬魚無死亡。取馴養(yǎng)的體質(zhì)量 (0.06 ± 0.01) g、體長(zhǎng) (1.62±0.31) cm、行動(dòng)比較敏捷活潑、狀態(tài)較佳的魚進(jìn)行慢性TCS 暴露實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TCS，美國(guó)Sigma，純度 ＞ 98.0%；二甲基亞砜（DMSO），天津紫明化工有限公司；2 g/L TCS母液，由DMSO 溶解TCS 配制而成；總RNA 極速抽提試劑盒，上海飛捷生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本東洋紡生物科技有限公司；BestarSybr Green qPCR master mix，德國(guó)DBI 公司；引物序列由華大基因合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

TCS 對(duì)斑馬魚96 h 半致死濃度（LC50）為0.34 mg/L[11]，據(jù)此，設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組和3 個(gè)質(zhì)量濃度分別為0.017、0.034、0.068 mg/L 的TCS 處理組，3 個(gè)處理組分別用TCS 母液配制而成，濃度分別為L(zhǎng)C50的1/20、1/10、1/5?？瞻讓?duì)照組和處理組中DMSO 體積分?jǐn)?shù)為0.07%。每組設(shè)置兩個(gè)平行組，每個(gè)水族箱水量為20 L，投放斑馬魚100 尾；水質(zhì)指標(biāo)同馴養(yǎng)。然后以半靜態(tài)染毒法（每天換水10 L，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的染毒液）對(duì)斑馬魚進(jìn)行連續(xù)染毒。每天定時(shí)投放飼料及清除排泄物。

1.4 樣本的制備

斑馬魚生命周期為4 個(gè)月左右，本暴露實(shí)驗(yàn)采用2 月齡斑馬魚。為探討TCS 對(duì)斑馬魚從幼齡階段到成齡階段肝胰臟細(xì)胞凋亡的影響，因此進(jìn)行了42 d 的TCS 連續(xù)染毒試驗(yàn)，暴露試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每缸死魚尾數(shù)均小于5%，且染毒組和對(duì)照組無顯著差異。然后，選出生長(zhǎng)狀況良好的斑馬魚進(jìn)行解剖。每個(gè)濃度組取6 個(gè)樣本（兩個(gè)平行缸分別取3 個(gè)樣本），每個(gè)樣本由隨機(jī)取的5 尾雌性斑馬魚的肝胰臟組成。然后迅速轉(zhuǎn)移并保存在超低溫冰箱中用于后期凋亡相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)。

1.5 凋亡相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

1.5.1 引物序列β-actin、Bax、MDM2、p53和Bcl-2基因的引物序列參考文獻(xiàn)[12]，詳見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Sequences of PCR primer

1.5.2 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 按照總RNA 極速抽提試劑盒提供的方法，提取雌性斑馬魚的肝胰臟組織總RNA。用凝膠電泳分析RNA 質(zhì)量，并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度。對(duì)質(zhì)量好且純度高的RNA 樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5.3 普通PCR 將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 加入目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物，2×Taq MasterMix 及無菌水，制備25 μL 反應(yīng)體系，根據(jù)普通PCR 步驟進(jìn)行擴(kuò)增。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各基因的表達(dá)結(jié)果。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析各基因溶解曲線發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參β-actin及目的基因Bcl-2、p53、MDM2和Bax基因熔解曲線均為單峰，且單峰橫坐標(biāo)均為相同熔解溫度，因此引物特異性良好，可以用來進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。

用cDNA、目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、BestarSybr Green qPCR master mix 及無菌水制備20 μL 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

從實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增后的數(shù)據(jù)中提取熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CQ值），用2-ΔΔt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)。采用最小顯著差數(shù)法（LSD 法）分析對(duì)照組與處理組之間的差異，顯著性水平α為0.05 或0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示，經(jīng)比較各濃度組各基因與內(nèi)參基因，以及同一基因?qū)φ战M和TCS 處理組灰度值之比，發(fā)現(xiàn)p53在TCS 各處理組的表達(dá)升高；Bcl-2、MDM2和Bax基因表達(dá)降低。

2.2 三氯生對(duì)雌性斑馬魚凋亡相關(guān)基因表達(dá)的定量分析

如圖2 所示，各TCS 濃度組Bcl-2基因與對(duì)照組相比表達(dá)極顯著下調(diào)，0.017、0.034、0.068 mg/L組依次下調(diào)97.98%、75.97%、99.51%。各TCS 濃度組p53基因與對(duì)照組相比表達(dá)極顯著上調(diào)，在TCS 濃度為0.017 mg/L 時(shí)上調(diào)最為明顯，上調(diào)21.79倍。質(zhì)量濃度為0.034、0.068 mg/L 時(shí)分別上調(diào)12.46倍和12.24 倍。

圖1 不同TCS 濃度組內(nèi)參及目的基因的表達(dá)Fig.1 Expression of genes in the groups with different TCS concentration

各TCS 濃度組MDM2基因與對(duì)照組相比均呈現(xiàn)極顯著下調(diào)，0.017、0.034、0.068 mg/L 組依次下調(diào)99.26%、92.78%、75.69%。與對(duì)照組相比，TCS處理組的Bax基因亦極顯著下調(diào)，0.017、0.034、0.068 mg/L 組依次下調(diào)94.26%、99.63%和98.89%。

同時(shí)，從圖2 的結(jié)果也可以看出，Bax/Bcl-2比值呈現(xiàn)先升高，后下降再升高的趨勢(shì)。

圖2 TCS 對(duì)雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of TCS on expression of apoptosis-related genes in female zebrafish hepatopancreas

3 討論

3.1 TCS對(duì)斑馬魚肝胰臟中Bcl-2 與Bax 表達(dá)的影響

脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡是由多種基因共同控制的細(xì)胞程序性死亡，是維持生物正常生理過程和功能活動(dòng)所必須的。Bcl-2 蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)蛋白。Bcl-2基因是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其表達(dá)量直接或間接影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，抑制凋亡[13]，從而保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[14-15]。Bax基因?yàn)锽cl-2 家族的主要促凋亡基因。Bcl-2與Bax形成一個(gè)調(diào)控系統(tǒng)：當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡；而當(dāng)細(xì)胞中的Bcl-2增多時(shí)會(huì)與Bax形成更加穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而中和Bax的促凋亡作用[16]。在本研究中，TCS 處理的雌性斑馬魚肝胰臟中Bcl-2與Bax的表達(dá)量均顯著下降。這可能是由于TCS 染毒液抑制了Bcl-2基因的表達(dá)，因Bcl-2基因表達(dá)的減少導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放大量的Ca2+，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這與劉林等[17]的納米氧化鋅對(duì)斑馬魚鰓中Bcl-2基因表達(dá)量影響的結(jié)果相一致。有研究表明，Bax/Bcl-2比值的升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究中Bax的表達(dá)量也極顯著下調(diào)，但Bax/Bcl-2比例呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)低濃度和高濃度組TCS 促進(jìn)了斑馬魚肝胰臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3.2 TCS 對(duì)斑馬魚肝胰臟MDM2 和p53 表達(dá)的影響

MDM2基因是p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的下游基因，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和細(xì)胞周期等生命過程，對(duì)維持生命活動(dòng)的穩(wěn)定有重要作用。MDM2可與p53的N 端區(qū)域結(jié)合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄，并可將p53運(yùn)出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而降解[18-19]。p53為抑癌因子，其產(chǎn)物對(duì)多種下游基因有調(diào)節(jié)作用[20,21]。它在調(diào)控復(fù)雜的DNA 損傷系統(tǒng)中起轉(zhuǎn)錄因子作用，DNA 的損傷會(huì)引起p53表達(dá)量增高，其產(chǎn)物會(huì)激活下游抑制細(xì)胞周期素依賴性激酶活性，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程[22]。本研究中，經(jīng)TCS 處理的斑馬魚MDM2基因的表達(dá)量均顯著下降，而p53基因的表達(dá)顯著升高，在TCS 質(zhì)量濃度為0.017 mg/L 時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的20 倍。這進(jìn)一步證實(shí)了TCS 加速雌性斑馬魚肝胰臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生，與周迎芳等[23]的F-2 毒素對(duì)小鼠卵巢細(xì)胞凋亡影響結(jié)果一致。

綜上，0.017 mg/L 的TCS 顯著影響了雌性斑馬魚肝胰臟凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而可能導(dǎo)致肝胰臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。該濃度高于自然河水中的最高質(zhì)量濃度2.3 μg/L，但低于污水處理廠進(jìn)水質(zhì)量濃度86.2 μg/L，表明隨著這類抗菌劑的大范圍應(yīng)用，可能會(huì)對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。