楊文聰，劉亞月，楊靜明，黎釗坪，梁金月，聶影影，馬小翔，張 翼

（1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室// 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心// 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088）

海洋真菌所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)多樣的次級(jí)代謝物是藥物發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源之一[1-2]。它們通常具有抗腫瘤、抗HIV、抗真菌、抗細(xì)菌、抗AChE 和抗氧化等生物活性，作為藥物先導(dǎo)化合物日益受到研究者的關(guān)注[3-6]。然而，這些化合物只是真菌次生代謝潛力的“冰山一角”，為了充分挖掘菌株潛力，表觀(guān)遺傳修飾、等離子體誘變、基因組挖掘和共培養(yǎng)等各種方法被用于激活微生物天然產(chǎn)物沉默生物合成途徑[7-10]。表觀(guān)遺傳修飾方法主要通過(guò)抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；福蚱渚哂休^好的實(shí)用性，是一種越來(lái)越受重視的化學(xué)誘導(dǎo)手段[11-12]。

黑甲肉座菌Hypocrea lixii（哈茨木霉Trichoderma harzianum的有性型），為廣泛存在于植物的內(nèi)生真菌，也是重要的生物防治用途的菌株。對(duì)該真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少，值得深入研究[13]。本實(shí)驗(yàn)室從大連海濱的海綿中分離得到一株真菌H.lixiiDLEN2008010，前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株代謝產(chǎn)物具有DPPH 自由基清除活性及AChE抑制活性[14]。另外，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)H.lixii這個(gè)種的菌株能產(chǎn)生異黃酮類(lèi)化合物[15]，該類(lèi)化合物通常顯示出較好的抗腫瘤、抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制活性[16-18]。然而，關(guān)于H.lixii次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中未見(jiàn)使用表觀(guān)遺傳修飾誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性的報(bào)道。為了深入挖掘H.lixiiDLEN2008010 的代謝潛力，并發(fā)現(xiàn)抗老年癡呆相關(guān)活性的代謝產(chǎn)物，本研究使用了一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑鹽酸普魯卡因刺激該真菌，分析其對(duì)菌株次級(jí)代謝的影響，從其固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離異黃酮類(lèi)化合物，并對(duì)其抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 Advance 500 MHz 核磁共振波譜儀，maXis Q-TOF 高分辨質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Epoch2 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 BüChi 公司）；HPX-9082MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱，BSC-1300ⅡA2生物安全柜（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；IRM-100全自動(dòng)高壓滅菌鍋（德國(guó)愛(ài)安姆公司）；HP Plus 50D超高壓液相色譜儀（蘇州利穗有限公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

電鰻乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE），C3389；碘代硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATCI），DA0048；牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA），A1933；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH），D9132；海鹽，S9883 均購(gòu)自Sigma-Aldrich；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB），D8130，購(gòu)自Ruibio 公司；鹽酸普魯卡因，購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司；瓊脂、蛋白胨均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司的生物純?cè)噭?；其余試劑均為?guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；硅膠（0.15 mm～ 0.3 mm 和0.05 mm～ 0.075 mm）購(gòu)自青島海洋化工廠(chǎng)；Sephadex LH-20，購(gòu)自瑞士GE-Healthcare Bio-sciences公司；ODS-AP 反相制備色譜柱（20 mm×250 mm，15 μm，大連依利特公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 海洋真菌Hypocrea lixiiDLEN2008010 分離自2008 年采集于中國(guó)遼寧省大連市付家莊海邊的海綿，經(jīng)ITS rDNA 全序列分析確定為黑甲肉座菌（Genbank 登錄號(hào)：HQ149775），菌株保藏于廣東海洋大學(xué)海洋藥物研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 PDA 培養(yǎng)基：土豆汁500 mL（200 g 土豆熬至500 mL 土豆汁），蔗糖20 g，蛋白胨5 g，海鹽20 g，加入純水至1 L，121℃滅菌20 min（pH=7.2）。大豆培養(yǎng)基：往3 L 的錐形瓶加入500 g 大豆，500 mL 水，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 規(guī)模培養(yǎng)、提取及分離 往30 個(gè)平放且含有大豆培養(yǎng)基的錐形瓶，各加入20 mL 生理鹽水洗落的菌懸液，置于28℃培養(yǎng)2 d，待有新的菌體形成后，均勻加入20 mL 過(guò)濾除菌的鹽酸普魯卡因水溶液，使其最終濃度為10 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)30 d。規(guī)模培養(yǎng)結(jié)束后，重復(fù)三次往每個(gè)錐形瓶加入1 L甲醇，并超聲30 min，過(guò)濾，減壓濃縮濾液至3 L。

將上述粗提物用10 kg 的XAD-16 大孔樹(shù)脂吸附，并轉(zhuǎn)移至層析柱，通過(guò)加入純水將多糖除去，洗至流出液接近無(wú)色透明，后分別加入一個(gè)柱體積的甲醇、丙酮解吸附，真空濃縮至干，得粗提物1.2kg。

粗提物在減壓硅膠柱（0.15mm～ 0.3mm）依次經(jīng)石油醚（Pe）/乙酸乙酯（EtOAc）（體積比為7∶3、1∶1、3∶7）、Pe、氯仿（Chl）/甲醇（MeOH）（體積比為10∶1、5∶1）和純甲醇洗脫得Fr.1～Fr.7。Fr.5（5 g）在硅膠柱（0.05mm～ 0.075mm）經(jīng)Chl、Chl/ MeOH（體積比為 200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1）各一個(gè)體積洗脫得到SFr.5-1～ SFr.5-10。SFr.5-4（0.25 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱MeOH 洗脫得到組分SFr.5-4-1～ SFr.5-4-6。其中 SFr.5-4-4 經(jīng) pHPLC（ODS-AP，15 μm，20.0 mm × 250 mm）通過(guò)MeOH/H2O（體積比為1∶3）等度洗脫，在tR=16 min收集，得到化合物1（5 mg）。SFr.5-4-4 經(jīng)pHPLC（色譜柱同上）通過(guò)MeOH/H2O（體積比為1∶3）等度洗脫，在tR=36 min收集得到化合物6（15 mg），在tR=48 min 收集得到化合物5（18 mg）。SFr.5-4-6經(jīng)pHPLC（色譜柱同上）通過(guò)MeOH/H2O（體積比為2∶3）等度洗脫，在tR=17 min 收集得到化合物2（8 mg）。SFr.5-6（0.62 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱MeOH 洗脫得到組分SFr.5-6-1～ SFr.5-6-6，從SFr.5-6-6 中使用硅膠制備薄層層析[展開(kāi)劑為Chl/MeOH（體積比為10∶1）]得到化合物7（5 mg）。SFr.5-8（0.19 g）經(jīng)pHPLC（色譜柱同上）通過(guò)MeOH/H2O（體積比為3∶7）等度洗脫，在tR=26 min 收集得到化合物4（5 mg）。Fr.4（4.3 g）在硅膠柱（0.05mm～0.075mm）經(jīng)Pe/EtOAc（體積比為1∶1）洗脫至純乙酸乙酯，分別得到SFr.4-1～ SFr.4-9。其中SFr.4-4（0.73 g）經(jīng)ODS 反相層析柱通過(guò)MeOH/H2O（體積比為2∶3）等度洗脫，得到化合物3（100 mg）。

1.2.2 HPLC 指紋圖譜分析 通過(guò)Agilent Infinity II 1260 分析在大豆培養(yǎng)基提取物及不同條件下Hypocrea lixii發(fā)酵提取物的HPLC 指紋圖譜。洗脫梯度如下：0～35 min，從體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇-H2O線(xiàn)性洗至100%甲醇；35～40 min，100%甲醇；40～42 min，純甲醇線(xiàn)性洗至體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇-H2O；42～ 45 min，體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇-H2O。進(jìn)樣量10 μL，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.3 AChE 抑制活性測(cè)定 通過(guò)優(yōu)化的Ellman 比色法[19]在96 孔板中測(cè)定化合物對(duì)AChE 體外抑制活性。將化合物溶解于DMSO 并配成10 mmol/L 且進(jìn)行倍半梯度稀釋?zhuān)?6 孔板中每孔加1 μL 不同濃度樣品，再依次加入49μL PBS、10μL 0.2 U/mL AChE 和20 μL DTNB，將96 孔板置于37℃培養(yǎng)箱保溫10 min。然后往每個(gè)孔加入20 μL ATCI，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)箱孵育。20 min 后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定λ405處的吸光值，并通過(guò)下述公式計(jì)算化合物對(duì)AChE的抑制率，其中Asampleblank為加入樣品和BSA 而不加入AChE 的吸光度，Asample為加入樣品和AChE的吸光度，Acontrol為加入AChE 而不加入樣品的吸光度，Ablank為加入BSA 而不加入樣品和AChE 的吸光度。鹽酸化多奈哌齊作為陽(yáng)性對(duì)照。

IC50值是化合物對(duì)AChE 抑制率為50%所對(duì)應(yīng)的濃度。將抑制率和濃度對(duì)數(shù)（lnC）導(dǎo)入Origin 8.0軟件。通過(guò)三次多項(xiàng)式回歸方程擬合得到濃度對(duì)數(shù)曲線(xiàn)，并計(jì)算得到ln（IC50）。最后使用Microsoft Excel 計(jì)算得到IC50。

1.2.4 DPPH 自由基清除活性測(cè)定 使用Sharma和Bhat 描述的DPPH 自由基清除法[20]，在96 孔板中測(cè)定化合物的抗氧化能力。總反應(yīng)體系為100μL，Asample為含有50μL 的0.16 mmol/L DPPH 和50μL溶解不同濃度化合物的DMSO。與此同時(shí)，50 μL 1.6 mmol/L DPPH 和50 μL DMSO 用作對(duì)照（Acontrol），50 μLMeOH 和50 μL 溶解不同濃度化合物的DMSO 作為樣品本底（Asampleblank），50 μLMeOH 和50 μL DMSO 作為空白（Ablank），將96 孔板放置在暗處30 min。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定λ517處的吸光度。維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照。

EC50值是化合物對(duì)DPPH 自由基清除率為50%所對(duì)應(yīng)的濃度。將清除率和濃度對(duì)數(shù)（lnC）導(dǎo)入Origin 8.0 軟件。通過(guò)三次多項(xiàng)式回歸方程擬合得到濃度對(duì)數(shù)曲線(xiàn)，并計(jì)算得到ln（EC50）。最后使用Microsoft Excel 計(jì)算得到EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

本研究從該菌株化學(xué)誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)物中共分離到以下7 種化合物（圖1）。

圖1 化合物1～7 的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1～7

2.1.1 化合物1 化合物1 為淺黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為25∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.56，硫酸-茴香醛顯色為黃色。該化合物易溶于丙酮。HR-ESI-MS，m/z 計(jì)算值：499.1250（C25H23O11-，[M-H]-）；實(shí)測(cè)值：499.1240，確定分子式為C25H24O11，不飽和度為14；1H NMR 在δH3.45（1H，t，H-4’’），3.54（1H，m，H-2’’），3.59（1H，m，H-3’’），3.90（1H，m，H-5’’）和5.17（1H，d，J=7.5，H-1’’）提示分子中存在一個(gè)糖環(huán)的片段，在δH6.89（2H，dd，J=6.5，2.0 Hz，H-3’/5’）和7.44（2H，dd，J=7.0，2.0 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，Acetone-d6）：δH1.87（3H，dd，J=6.9，1.7 Hz，H-4’’’），3.45（1H，t，H-4’’），3.54（1H，m，H-2’’），3.59（1H，m，H-3’’），3.90（1H，m，H-5’’），4.22（1H，dd，J=11.9，7.4 Hz，Ha-6’’），4.54（1H，dd，J=12.0，2.1 Hz，Hb-6’’），5.17（1H，d，J=7.5，H-1’’），5.90（1H，dd，J=15.6，1.7 Hz，H-2’’’），6.47（1H，d，J=2.2 Hz，H-6），6.66（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.89（2H，dd，J=8.7，2.0 Hz，H-3’/5’），6.97（1H，dq，J=15.5，6.7 Hz，H-3’’’），7.44（2H，dd，J=8.7，2.0 Hz，H-2’/6’），8.24（1H，s，H-2），8.60（1H，brs，4’-OH），13.00（1H，s，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，Acetone-d6）：δC18.1（C-4’’’），64.1（C-6’’），71.3（C-4’’），74.5（C-2’’），75.2（C-5’’），77.8（C-3’’），95.5（C-8），100.6（C-6），101.2（C-1’’），107.6（C-10），116.0（C-3’/5’），122.8（C-3），123.2（C-2’’’），124.3（C-1’），131.2（C-2’/6’），145.8（C-3’’’），154.8（C-2），158.6（C-4’），163.5（C-5），164.3（C-7），166.4（C-1’’’），181.9（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR，且通過(guò)J1’’2’’＞7.0 Hz確定葡萄糖殘基的β 構(gòu)型，通過(guò)J2’’’3’’’＞15.0 Hz 確定側(cè)鏈雙鍵的反式構(gòu)型，并與文獻(xiàn)[21]比對(duì)，確定該化合物為6''-O-crotonylgenistin。

2.1.2 化合物2 化合物2 為白色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.51，硫酸-茴香醛顯色為黃色。該化合物易溶于丙酮。1H NMR 在δH6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’/5’）和7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，Acetone-d6）：δH6.28（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.42（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’/5’），7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-2’/6’），8.15（1H，s，H-2），9.00（1H，brs，4’-OH），13.02（1H，s，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，Acetone-d6）：δC94.5（C-8），99.9（C-6），106.1（C-10），116.0（C-3’/5’），123.1（C-1’），124.0（C-3），131.2（C-2’/6’），154.3（C-2），158.4（C-4’），159.1（C-9），163.9（C-5），165.3（C-7），181.6（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR 并與文獻(xiàn)[22]比對(duì)，確定該化合物為genistein。

2.1.3 化合物3 化合物3 為淺黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.50，硫酸-茴香醛顯色為淺紫色。該化合物易溶于DMSO。1H NMR 在δH6.80（1H，d，J=8.7 Hz，H-3’/5’）和7.37（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH6.81（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），6.80（2H，d，J=8.7 Hz，H-3’/5’），6.90（1H，dd，J=8.8，2.3 Hz，H-6），7.37（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’/6’），7.94（1H，d，J=8.7 Hz，H-5），8.26（1H，s，H-2），9.60（1H，brs，4’-OH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC102.0（C-8），114.9（C-3’/5’），115.5（C-6），116.2（C-10），122.6（C-3），123.4（C-1’），127.2（C-5），130.1（C-2’/6’），152.7（C-2），157.1（C-4’），157.5（C-9），163.4（C-7），174.6（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR 并與文獻(xiàn)[23]比對(duì)，確定化合物為daidzein。

2.1.4 化合物4 化合物4 為淺黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.1，硫酸-茴香醛顯色為無(wú)色。該化合物易溶于DMSO。1H NMR 在δH3.17（1H，t，J=9.0 Hz，H-4’’）、3.26（1H，m，H-2’’）、3.31（1H，m，H-3’’）、3.45（2H，m，H-5’’，H-6’’b）、3.71（1H，d，J=7.6 Hz，H-6’’a）和5.06（1H，d，J=7.6 Hz，H-1’’）提示分子中存在一個(gè)糖環(huán)的片段，δH6.83（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-3’/5’）和7.40（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH3.17（1H，t，J=9.0 Hz，H-4’’），3.26（1H，m，H-2’’），3.31（1H，m，H-3’’），3.45（2H，m，H-5’’，H-6’’b），3.71（1H，d，J=7.6 Hz，H-6’’a），5.06（1H，d，J=7.6 Hz，H-1’’），6.47（1H，d，J=2.2，H-6），6.72（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.83（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-3’/5’），7.40（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-2’/6’），8.43（1H，s，H-2），9.74（1H，brs，7-OH），12.94（1H，brs，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC60.6（C-6’’），69.6（C-4’’），73.1（C-2’’），76.4（C-3’’），77.2（C-5’’），94.5（C-8），99.6（C-6），99.9（C-1’’），106.1（C-10），115.1（C-3’,C-5’），121.0（C-1’），122.6（C-3），130.2（C-2’,C-6’），154.6（C-2），157.2（C-9），157.6（C-4’），161.6（C-5），163.0（C-7），180.5（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR，且通過(guò)J1’’2’’＞7.0 Hz確定葡萄糖殘基的β 構(gòu)型，并與文獻(xiàn)[24]比對(duì)，確定該化合物為genistin。

2.1.5 化合物5 化合物5 為黃色非晶型固體，在氯仿/甲醇（體積比為10∶1）的60 F254TLC 的Rf值為0.87，硫酸-茴香醛顯色為檸檬黃。該化合物易溶于甲醇、丙酮。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，acetone-d6）：δH3.77（3H，s，H3-8），5.40（2H，brs，4-NH2），6.67（2H，dd，J=6.3，1.4 Hz，H-3/5），7.72（2H，dd，J=6.3，1.4 Hz，H-2/6）。

13C NMR（125 MHz，acetone-d6）：δC51.4（C-8），113.9（C-3,C-5），118.5（C-1），132.1（C-2,C-6），154.0（C-4），167.3（C-7）。

分析1H NMR、13C NMR 并與文獻(xiàn)[25]比對(duì)，確定該化合物為對(duì)氨基苯甲酸甲酯。

2.1.6 化合物6 化合物6 為淺黃色針狀結(jié)晶，在甲醇/水（體積比為2∶3）的C18TLC 的Rf值為0.43，硫酸-茴香醛顯色為粉色。該化合物易溶于甲醇。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，CD3OD）：δH2.53（2H，t，J=7.7 Hz，H2-8），2.80（2H，t，J=7.7 Hz，H2-7），6.69（2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-3/5），7.03（2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-2/6）。

13C NMR（125 MHz，CD3OD）：δC31.2（C-7），37.2（C-8），116.2（C-3,C-5），133.0（C-1），130.2（C-2,C-6），156.7（C-4），177.0（C-9）。

分析NMR 數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[26]比對(duì)，確定化合物為對(duì)羥基苯丙酸。

2.1.7 化合物7 化合物7 為淺黃色針狀結(jié)晶，在甲醇/水（體積比為4∶1）的C18TLC 的Rf值為0.8，硫酸-茴香醛顯色無(wú)色。該化合物易溶于DMSO。核磁波譜數(shù)據(jù)如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH5.44（1H，d，J=7.6 Hz，H-5），7.37（1H，d，J=7.6 Hz，H-6），10.94（2H，brs，1-NH/3-NH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC100.2（C-5），142.3（C-6），151.6（C-2），164.3（C-4）。

分析NMR 數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[27]比對(duì)，確定該化合物為尿嘧啶。

2.2 HPLC 指紋圖譜

為了考察鹽酸普魯卡因?qū)Ｑ笳婢诩兹庾鶫ypocrea lixii次生代謝產(chǎn)物的影響及化合物來(lái)源，對(duì)大豆培養(yǎng)基提取物及H.lixii在不同條件下（添加或未添加鹽酸普魯卡因的大豆培養(yǎng)基）發(fā)酵提取物的指紋圖譜做了對(duì)比。

結(jié)果如圖2 所示，在大豆培養(yǎng)基提取物及正常大豆培養(yǎng)基中菌株的發(fā)酵提取物（圖2-A和圖2-B）中均未能檢測(cè)到化合物1，而在添加了鹽酸普魯卡因的Soy 培養(yǎng)基中該原始菌株的代謝物（圖2-C）能夠產(chǎn)生化合物1?；衔?～4 在大豆培養(yǎng)基提取物指紋圖譜（圖2-A）中也觀(guān)察到了保留時(shí)間相近、紫外吸收特征相同的峰。

化合物5 僅存在于添加了誘導(dǎo)劑鹽酸普魯卡因的發(fā)酵提取物中，而化合物6 在有無(wú)添加誘導(dǎo)劑的發(fā)酵產(chǎn)物中都存在，而未見(jiàn)于大豆培養(yǎng)基提取物中（相同保留時(shí)間處雖有色譜峰，但紫外光譜有差異），化合物7 也主要存在于兩種發(fā)酵產(chǎn)物中，在大豆培養(yǎng)基中未見(jiàn)明顯色譜峰。

另外，加了鹽酸普魯卡因誘導(dǎo)的菌株能產(chǎn)生一些僅在大豆培養(yǎng)基中發(fā)酵所不能產(chǎn)生的代謝物（如保留時(shí)間4.9 min、6 min、20 min、28.5 min 處的峰），同時(shí)還能刺激H.lixii提高某些在大豆培養(yǎng)基中發(fā)酵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量（如保留時(shí)間1.0～2.5 min 及8 min 處的峰），這些代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。

圖2 254 nm 下大豆培養(yǎng)基及Hypocrea lixii DLEN2008010 不同培養(yǎng)條件發(fā)酵提取物的HPLC 指紋圖譜.Fig.2 The 254 nm detected HPLC fingerprints for soybean cultural medium and Hypocrea lixii DLEN2008010 fermentation extracts under different cultural conditions.

2.3 抗氧化活性

采用Sharma 和Bhat 描述的DPPH 自由基清除法對(duì)化合物1～6 進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，化合物7 因?yàn)榭紤]到只是普通的堿基，故未測(cè)活性。結(jié)果顯示，化合物1～4 在100 μmol/L 劑量濃度下顯示了較弱的DPPH 自由基清除活性（表1）。

表1 化合物1～ 4 的DPPH 自由基清除活性Table 1 The DPPH free radical scavenging activities of compounds 1– 4

2.4 乙酰膽堿酯酶抑制活性

采用改良的Ellman比色法對(duì)化合物1～6進(jìn)行抗乙酰膽堿酯酶活性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，在100 μmol/L劑量濃度下化合物1～4 活性較微弱，而化合物5 和6 活性相對(duì)較明顯（表2）。

表2 化合物1～ 4 的AChE 抑制活性Table 2 The inhibitory activities for AChE of compounds 1– 4

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，化合物1 僅在添加了化學(xué)誘導(dǎo)劑的發(fā)酵產(chǎn)物中被檢測(cè)到，推測(cè)是在誘導(dǎo)劑的刺激下，菌株相關(guān)代謝基因被激活，從而利用大豆中的異黃酮代謝產(chǎn)生了化合物1。該化合物首次被發(fā)現(xiàn)是從紅曲霉發(fā)酵黑豆中分離得到的[21]，本文為其第二次報(bào)道，也是首次從Hypocrea lixii發(fā)酵大豆中分離得到?；衔?～4 則普遍存在于大豆中[28]，在大豆培養(yǎng)基提取物指紋圖譜中也存在，因此推測(cè)它們?cè)醋耘囵B(yǎng)基。

從結(jié)構(gòu)相關(guān)性上推測(cè)，化合物5 與鹽酸普魯卡因均含有對(duì)氨基苯甲酸片段，推測(cè)該化合物為鹽酸普魯卡因被真菌代謝所產(chǎn)生，這也是該化合物生物轉(zhuǎn)化來(lái)源的首次報(bào)道。

化合物6 在有無(wú)添加誘導(dǎo)劑的發(fā)酵產(chǎn)物中都存在，而在大豆培養(yǎng)基提取物中未檢測(cè)到，而且該化合物曾從海洋細(xì)菌、多黏類(lèi)芽孢桿菌、陸生真菌等微生物以及小葉榕等來(lái)源分離得到（而未見(jiàn)于大豆中報(bào)道）[26,29-31]，因此我們推測(cè)它為H.lixii的代謝產(chǎn)物，本研究為首次從真菌Hypocrea lixii中分離得到?；衔? 則為生命基礎(chǔ)代謝成分，推測(cè)真菌發(fā)酵使得大豆的核酸類(lèi)成分降解從而提高了其含量。

表觀(guān)遺傳修飾是一種運(yùn)用較方便的化學(xué)誘導(dǎo)手段，其主要作用機(jī)制是通過(guò)抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶酶或組蛋白去乙?；福瑥亩谷旧w的結(jié)構(gòu)局部松散化，利于DNA 與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而促進(jìn)沉默基因的表達(dá)和相應(yīng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[32]。在利用該手段對(duì)真菌進(jìn)行化學(xué)表觀(guān)遺傳修飾時(shí)，菌株對(duì)誘導(dǎo)劑種類(lèi)及其劑量的敏感性非常重要，普魯卡因是一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，De Feliciode等發(fā)現(xiàn)普魯卡因與丙戊酸共同作用可促進(jìn)炭角菌代謝[33]，在本研究之前對(duì)一株海洋爪曲霉的研究中，發(fā)現(xiàn)普魯卡因與NaBr 可協(xié)同誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生2 種縮酚酸環(huán)醚類(lèi)化合物[34]。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)普魯卡因?qū)е翲.lixii可產(chǎn)生僅此條件下出現(xiàn)的化合物1 及一些尚待鑒定的化合物，并提高一些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。上述表明該表觀(guān)遺傳修飾劑有較廣泛的作用對(duì)象。

在活性篩選中，化合物1～6 顯示了較弱的抗氧化及乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中化合物5 和6 的乙酰膽堿酯酶抑制活性相對(duì)較強(qiáng)（未見(jiàn)前人報(bào)道），考慮到化合物1 的2 個(gè)類(lèi)似物曾從黃芪中分離得到并被報(bào)道具有抗炎活性[35]，化合物5 及其衍生物曾被報(bào)道具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的促骨再生作用[36]，化合物6 曾被報(bào)道具有抗炎活性[31]，這些化合物的活性還有待進(jìn)一步擴(kuò)大篩選研究以挖掘其應(yīng)用價(jià)值。該菌株提取物中的其他成分也有待繼續(xù)進(jìn)行深入分離鑒定及活性研究。

4 結(jié)論

本研究對(duì)一株海洋真菌Hypocrea lixiiDLEN2008010 采用鹽酸普魯卡因進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)，從中分離鑒定了7 個(gè)化合物，并研究了其抗氧化及乙酰膽堿酯酶抑制活性。其中化合物1 是從Hypocrea lixii分離得到的首個(gè)具有丁烯酰側(cè)鏈的染料木素糖苷，化合物6 也為首次該菌中分離得到，豐富了該菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性。化合物5 為生物轉(zhuǎn)化來(lái)源的首例報(bào)道。化合物5 和6 表現(xiàn)了一定程度的乙酰膽堿酯酶抑制活性，為首次報(bào)道。鹽酸普魯卡因?qū)υ摼拇紊x有顯著影響，該菌株的化學(xué)成分研究工作還在繼續(xù)深入進(jìn)行之中，有待后續(xù)報(bào)道。