金翠紅, 劉淑娟, 靜金艷

(1.河北省灤平縣中醫(yī)院， 河北 灤平 068250 2.河北省承德市婦幼保健院， 河北 承德 067000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率高，而晚期宮頸癌易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，侵襲性、淋巴轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差[1]。在治療過(guò)程中抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡是治療腫瘤的關(guān)鍵。普魯卡因是一種常見(jiàn)的麻醉藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其還有抗腫瘤作用，如普魯卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[2]。普魯卡因還可抑制人類白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis-inducingand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，臨床上是極具潛能的抗腫瘤藥物[4]。研究發(fā)現(xiàn)TRAIL能夠誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞凋亡而不損傷正常細(xì)胞[5]。但普魯卡因和TRAIL對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響還尚未清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在研究普魯卡因和TRAIL對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及普魯卡因是否通過(guò)TRAIL影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡。

1 材料與方法

1.1材料：宮頸癌細(xì)胞SiHa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；普魯卡因購(gòu)自福州海王福藥制藥有限公司；Lipofectamine TM 2000購(gòu)自Sigma公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；載體質(zhì)粒均由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):宮頸癌細(xì)胞SiHa用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d換液一次，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物處理與分組:當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，將細(xì)胞傳代接種至96孔板中，并用不同濃度的普魯卡因(0.0 mM/L、0.5 mM/L、1 mM/L、2 mM/L)處理SiHa細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為普魯卡因0.0 mM/L組、普魯卡因0.5 mM/L組、普魯卡因1 mM/L組、普魯卡因2 mM/L組。將pcDNA、pcDNA-TRAIL轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，記為pcDNA組、pcDNA-TRAIL組；將si-NC、si-TRAIL轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞后用2mM/L的普魯卡因處理，分別記為普魯卡因2mM/L+si-NC組、普魯卡因2mM/L+si-TRAIL組，轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖:在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48h時(shí)加入20μL(5g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150μL DMSO振蕩反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。每組重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)TRAIL mRNA的表達(dá)水平:收集不同濃度普魯卡因處理組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30s，60℃ 30s；72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h。分別加入一抗(1:1000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入二抗(1:2000)室溫孵育2h，TBST洗滌3次，每次10min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1普魯卡因?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的影響:Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖1A，表1)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸顯著降低，P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖抑制率逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖1B，表1)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡率顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)?？梢?jiàn)，普魯卡因抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。A:增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B：宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡

表1 普魯卡因?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響

圖1 普魯卡因?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖2 TRAIL蛋白表達(dá)

2.2普魯卡因?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞中TRAIL表達(dá)的影響:qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞中TRAILmRNA的表達(dá)水平逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖2，表2)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞中TRAIL蛋白的表達(dá)水平逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)?？梢?jiàn)，普魯卡因促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)。

表2 普魯卡因?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞中TRAIL表達(dá)的影響

2.3過(guò)表達(dá)TRAIL對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響:Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖3，表3)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖抑制率逐漸顯著升高(P<0.05)?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)TRAIL抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖。

表3 過(guò)表達(dá)TRAI對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響

表4 過(guò)表達(dá)TRAIL對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響

圖3 TRAIL和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4 TRAIL和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4過(guò)表達(dá)TRAIL對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響:Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖4，表4)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Caspase-8、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(表4)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)TRAIL促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡。

圖5 抑制TRAIL表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.5抑制TRAIL逆轉(zhuǎn)普魯卡因抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用:Western Blot檢測(cè)結(jié)果(圖5，表5，表6)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高；與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比，普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果(表5)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖抑制率顯著升高；與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比，普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(表6)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡率顯著升高；與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比，普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)?？梢?jiàn)，抑制TRAIL逆轉(zhuǎn)了普魯卡因抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

表5 抑制TRAIL表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響

表6 抑制TRAIL表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

宮頸癌嚴(yán)重地威脅廣大女性生命健康，尋找多種有效治療方法對(duì)治療宮頸癌具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)普魯卡因可抑制脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞腫瘤侵襲性行為[6]。普魯卡因還可通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA使ERK / MAPK / FAK通路失活來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]。鹽酸普魯卡因通過(guò)去ID4基因甲基化抑制白血病HL-60細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普魯卡因抑制CyclinD1、Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)P21、Caspase-8、Bax的表達(dá)；抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；且還提高了TRAIL的表達(dá)水平。

TRAIL是一種凋亡分子，能與死亡受體特異性結(jié)合后選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療方面扮演著重要的角色，是一種有潛力的抗腫瘤細(xì)胞因子[8]。研究發(fā)現(xiàn)TRAIL可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡[9]。TRAIL-R1的單克隆抗體通過(guò)激活caspase-8途徑增強(qiáng)了TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。阻止caspase-8激活可抑制TRAIL介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TRAIL能促進(jìn)Caspase-8蛋白的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示TRAIL通過(guò)Caspase-8途徑影響了宮頸癌的凋亡。PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑PI-103與TRAIL聯(lián)合應(yīng)用可使細(xì)胞周期停滯在S期，CyclinD1表達(dá)水平降低，抑制喉鱗癌細(xì)胞增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)P21和TRAIL可抑制黑素瘤HTB-72細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TRAIL降低了CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，提高了P21蛋白的表達(dá)水平[12]。提示，TRAIL可能通過(guò)影響CyclinD1和P21的表達(dá)水平影響細(xì)胞增殖。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)抑制TRAIL表達(dá)逆轉(zhuǎn)了普魯卡因?qū)m頸癌細(xì)胞SiHa的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，提示普魯卡因可能影響TRAIL表達(dá)影響宮頸癌的凋亡。

綜上所述，普魯卡因可抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控TRAIL有關(guān)。將可為宮頸癌的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。