張 榮，徐丹丹，姜焰鳴，江立群，習(xí)平根，陳厚彬，姜子德

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院/博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，廣東 深圳 518055； 3 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 工程基礎(chǔ)教學(xué)與訓(xùn)練中心，廣東 廣州 510642；4 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

荔枝霜疫病由荔枝霜疫霉Peronophythora litchii引起，是造成荔枝果實(shí)褐變腐爛、產(chǎn)量降低和產(chǎn)量不穩(wěn)定的主要病害，在我國荔枝栽培區(qū)普遍發(fā)生[1-2]；該病為害荔枝新梢、嫩葉及花穗，在氣候條件適宜發(fā)病的年份，可引起荔枝產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)80%以上，嚴(yán)重限制了荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。

關(guān)于荔枝霜疫霉對(duì)溫濕度適應(yīng)性的研究多為溫度或者濕度單獨(dú)對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響，Chen等[4]研究臺(tái)灣地區(qū)的荔枝霜疫霉在V8汁培養(yǎng)基中，菌絲生長的溫度范圍為8～32 ℃，最適生長溫度為24～28 ℃；Liu等[5]研究華南地區(qū)的荔枝霜疫霉在PDA培養(yǎng)基中，菌絲生長溫度為12～32 ℃，最適生長溫度為 28～30 ℃；蔡學(xué)清等[6]研究認(rèn)為在24～28 ℃條件下，果實(shí)最易被荔枝霜疫霉侵染且發(fā)病最重；黃河等[7]認(rèn)為荔枝霜疫霉孢子囊遇水立即脫落。荔枝霜疫病的發(fā)生和流行與日照時(shí)數(shù)、降雨天數(shù)有關(guān)，日照時(shí)數(shù)和降雨天數(shù)直接影響果園的溫度和寄主露時(shí)，連續(xù)降雨數(shù)天即可造成該病害流行，且病害來勢(shì)兇猛，一旦發(fā)生便迅速擴(kuò)展蔓延[8]。因此，監(jiān)測(cè)種植區(qū)環(huán)境條件，結(jié)合物候期對(duì)病害發(fā)生進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，在其發(fā)病前期和初期采取有效的防治措施，對(duì)遏制病害的流行為害至關(guān)重要。Montone 等[9]通過監(jiān)測(cè)草莓葉片露時(shí)得到相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于草莓病害的預(yù)警系統(tǒng)中；Roubal等[10]依據(jù)降雨量、溫度及相對(duì)濕度等環(huán)境因素預(yù)測(cè)Fusicladium oleagineum對(duì)橄欖的侵染及潛伏期；Uysal等[11]探索了溫度、露時(shí)及葉齡對(duì)菠菜炭疽病菌侵染及擴(kuò)展的影響。而有關(guān)荔枝霜疫病發(fā)生的流行條件、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)方法等報(bào)道較少[12]。

農(nóng)作物病蟲害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)是植物保護(hù)工作的基礎(chǔ)，是實(shí)現(xiàn)防災(zāi)減害的重要保證。本研究在人工控溫、控濕條件下，研究溫度、露時(shí)(即寄主濕潤持續(xù)時(shí)間)對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響，以期為荔枝霜疫病監(jiān)測(cè)預(yù)警提供依據(jù)，提高預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 材料

葉片和果實(shí)接種試驗(yàn)選取的荔枝品種均為‘懷枝’。

荔枝霜疫霉菌株(編號(hào)SHS3)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系真菌研究室分離、鑒定和保存。菌株培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 溫度和露時(shí)對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響 葉片和果實(shí)上孢子囊萌發(fā)的觀察參考蔣繼志等[13]的方法并稍作改動(dòng)：選取長勢(shì)一致的嫩葉和成熟果實(shí)置于保鮮盒中，將玻璃紙剪成均等大小 (2 cm×2 cm)，于無菌水中浸濕后附著于葉片或果實(shí)表面；然后吸取10 μL 的孢子囊懸浮液 (1×104mL?1)滴于玻璃紙上，每個(gè)葉片或果實(shí)滴5滴，將葉片或果實(shí)分別放置在15、20、25和30 ℃條件下培養(yǎng)，待達(dá)到相應(yīng)的露時(shí)2、4、8、12 和 24 h 后，置玻璃紙于載玻片上，在顯微鏡下觀察孢子囊的萌發(fā)情況。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)至少計(jì)數(shù)100個(gè)孢子囊。

1.2.2 溫度和露時(shí)對(duì)葉片和果實(shí)感病的影響 荔枝葉片的接種方法參考Neufeld 等[14]和Arauz 等[15]的方法并稍作改動(dòng)。將孢子囊懸浮液噴霧接種于嫩葉上，至有液滴滴落。荔枝果實(shí)的接種方法：取新鮮的荔枝成熟果實(shí)用清水清洗后晾干，將果實(shí)在孢子囊懸浮液中浸泡1 min后取出。

將接種過的葉片分別于15、20、25和30 ℃條件下培養(yǎng)，接種過的果實(shí)分別于20、25和30 ℃條件下培養(yǎng)，待達(dá)到相應(yīng)的露時(shí) 2、4、8、12和24 h后，用強(qiáng)風(fēng)吹干葉片和果實(shí)，重新置于各自的培養(yǎng)溫度下，24 h后將所有的處理移至白天24 ℃、晚上 20 ℃、12 h 光暗交替、75%～90% 相對(duì)濕度下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。每天觀察葉片或果實(shí)的發(fā)病情況并記錄發(fā)病等級(jí)，計(jì)算接種3 d的病情指數(shù)。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)至少接種50片葉片或30顆果實(shí)。

葉片發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占葉片面積的1%～25%；2級(jí)，病斑面積占葉片面積的26%～50%；3級(jí)，病斑面積占葉片面積的51%～75%；4級(jí)，病斑面積占葉片面積的75%以上。

果實(shí)發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考Qu等[16]的方法并稍作修改。0級(jí)：果皮未出現(xiàn)病斑；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)果皮面積的5%以下；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)果皮面積的6%～15%；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)果皮面積的16%～25%；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)果皮面積的26%～50%；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)果皮面積的50%以上。

病害發(fā)生嚴(yán)重度計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)模型擬合

模型擬合采用SAS(9.4版本)軟件進(jìn)行分析。在Neufeld等[14]分析方法的基礎(chǔ)上略作修改，首先用初步方差分析法分析孢子囊萌發(fā)試驗(yàn)的3組重復(fù)、孢子囊侵染葉片試驗(yàn)的3組重復(fù)、侵染果實(shí)的2組重復(fù)是否有明顯差異，若無明顯差異，后續(xù)則取各組重復(fù)試驗(yàn)的平均值進(jìn)行分析。其次對(duì)孢子囊在葉片、果實(shí)上萌發(fā)及侵染試驗(yàn)分兩步進(jìn)行分析，第一步使用SAS中的PROC GLM過程分析比較溫度 (θ)、露時(shí) (t)以及它們的交互效應(yīng) (θ×t)對(duì)孢子囊萌發(fā)和寄主發(fā)病嚴(yán)重度的影響；第二步則以方程f(t,θ) ={1?exp[?(B×t)2]}/cosh[(θ?F)×G/2] 擬合模型。該模型是韋布爾函數(shù)的修正式，其中斜體小寫字母為自變量，大寫斜體字母為參數(shù)。B代表變量y響應(yīng)自變量露時(shí)(t)的固有增長率，F(xiàn)和G分別代表變量y響應(yīng)最佳溫度和溫度(θ)的固有變化率。使用SAS中的PROC NLIN過程，將孢子囊平均萌發(fā)率和寄主平均發(fā)病嚴(yán)重度分別擬合至非線性模型。使用SAS PROC REG過程分析孢子囊萌發(fā)率和寄主發(fā)病嚴(yán)重度觀察值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)性，評(píng)估模型擬合的可靠性。根據(jù)參數(shù)估計(jì)的顯著性、漸近標(biāo)準(zhǔn)誤差的大小評(píng)估模型的擬合優(yōu)度，使用MATLAB MESH制作孢子囊在葉片、果實(shí)上萌發(fā)和侵染的三維曲面圖。

1.4 病害風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型

通過擬合模型f(t,θ)產(chǎn)生t和θ的函數(shù)，預(yù)測(cè)發(fā)病嚴(yán)重程度。根據(jù)最終模型參數(shù)估算溫度和露時(shí)的范圍，使用 MATLAB CONTOUR 制作等高線圖，預(yù)測(cè)荔枝嫩葉和成熟果實(shí)霜疫病發(fā)生的嚴(yán)重度。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子囊萌發(fā)及寄主發(fā)病程度響應(yīng)溫度和露時(shí)的方差分析

方差分析結(jié)果(表1)表明孢子囊萌發(fā)、孢子囊侵染嫩葉和孢子囊侵染成熟果實(shí)響應(yīng)溫度和露時(shí)的重復(fù)試驗(yàn)之間的差異不顯著(P＞0.05)，因此可使用試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行后續(xù)分析。溫度、露時(shí)極顯著影響孢子囊的萌發(fā)及葉片、果實(shí)接種3 d后的病害嚴(yán)重度(P＜0.000 1)；溫度和露時(shí)的交互作用也可以顯著影響孢子囊的萌發(fā)及寄主發(fā)病的嚴(yán)重度(P＜0.01)。

表1 溫度和露時(shí)對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)及荔枝葉片、果實(shí)發(fā)病程度影響的方差分析Table 1 Analysis of variance for the effects of temperature and wetness duration on sporangia germination of Peronophythora litchii and disease severities of litchi leaf and fruit

2.2 不同溫度和露時(shí)對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響情況

荔枝霜疫霉孢子囊在溫度為15～30 ℃時(shí)，露時(shí)為2 h時(shí)即開始萌發(fā)，且萌發(fā)率隨著露時(shí)的延長而逐漸增大；在溫度為25 ℃時(shí)，所有露時(shí)處理?xiàng)l件下的孢子囊萌發(fā)率達(dá)到最大值。孢子囊在葉片上萌發(fā)率大于0.2的溫度為25 ℃，露時(shí)≥2 h或溫度20 和 30 ℃，露時(shí)≥4 h(圖1A)；在果實(shí)上孢子囊萌發(fā)率大于0.6的溫度為20和30 ℃，露時(shí)≥12 h或溫度 25 ℃，露時(shí)≥8 h(圖1C)。

圖1 不同溫度和露時(shí)處理下荔枝霜疫霉孢子囊在荔枝葉片和果實(shí)上的萌發(fā)率Fig. 1 Sporangia germination rates of Peronophythora litchii on litchi leaf and fruit under the conditions of different temperature and wetness duration

2.3 不同溫度和露時(shí)對(duì)葉片和果實(shí)發(fā)病程度的影響

露時(shí)相同的條件下，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，孢子囊為害荔枝嫩葉和成熟果實(shí)最為嚴(yán)重；所有的溫度處理下，葉片和果實(shí)的發(fā)病程度隨著露時(shí)延長而加重。相同的處理?xiàng)l件下，孢子囊為害果實(shí)比葉片更為嚴(yán)重和迅速(圖2)。荔枝葉片接種孢子囊后，溫度為 25 ℃，露時(shí)≥2 h 時(shí)，病害嚴(yán)重度可達(dá) 0.2；或者溫度為 20 或 30 ℃ 時(shí)，露時(shí)≥4 h；而溫度為 15 ℃時(shí)，則需露時(shí)≥12 h(圖2A)。果實(shí)接種孢子囊后，溫度為 25 ℃、露時(shí)≥2 h 或者溫度為 20 和 30 ℃、露時(shí)≥4 h，果實(shí)的病情指數(shù)即可超過0.6(圖2C)。

圖2 荔枝葉片和果實(shí)接種荔枝霜疫霉孢子囊3 d后的病情指數(shù)Fig. 2 Disease severity of litchi leaf and fruit at three days after inoculation with Peronophythora litchii sporangia

2.4 模型的參數(shù)估計(jì)和檢驗(yàn)

選用韋布爾模型的修正式，在SAS軟件中擬合得到了準(zhǔn)確度較好的孢子囊萌發(fā)和發(fā)病嚴(yán)重度模型f(t,θ) ={1?exp[?(B×t)2]}/cosh[(θ?F)×G/2]。模型很好地描述了溫度和露時(shí)對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響。孢子囊萌發(fā)率和病害嚴(yán)重度隨露時(shí)變化呈S形曲線，隨溫度變化呈單峰形曲線(圖1B、1D和圖2B、2D)。模型擬合的漸進(jìn)參數(shù)估計(jì)值均有效且差異顯著(P＜0.05)，近似標(biāo)準(zhǔn)誤差均較小(表2)。

從預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值相關(guān)性分析來看，孢子囊對(duì)葉片和果實(shí)萌發(fā)率的預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值差異不顯著(P＞ 0.05)，即可認(rèn)為預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值無差異，模型擬合效果較好，其決定系數(shù)(r2)分別為0.931 2和0.948 4；孢子囊侵染葉片和果實(shí)病害嚴(yán)重度的預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值差異不顯著(P＞0.05)，即可認(rèn)為預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值無差異，模型擬合效果較好，決定系數(shù)分別為 0.814 7 和 0.991 6(表3)。

2.5 病害風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)

根據(jù)荔枝嫩葉和成熟果實(shí)接種孢子囊3 d后的病害嚴(yán)重度的模型，制得相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等高線圖(圖3)。依據(jù)荔枝霜疫霉侵染葉片風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖可以推算出病害嚴(yán)重度從0.1～0.9變化所對(duì)應(yīng)的溫度和露時(shí)。當(dāng)溫度為 22～30 ℃、露時(shí)約為 3～24 h 時(shí)，葉片的病害嚴(yán)重度達(dá)到0.2以上(圖3A)。依據(jù)侵染果實(shí)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖可以推算出病害嚴(yán)重度從0.5～0.9變化所對(duì)應(yīng)的溫度和露時(shí)。由圖3B可知，荔枝霜疫霉為害果實(shí)更易成災(zāi)，當(dāng)溫度為15～30 ℃、露時(shí)約2～3 h時(shí)，果實(shí)發(fā)病的嚴(yán)重度高達(dá)0.6。因此，在荔枝果實(shí)接近成熟時(shí)，必須嚴(yán)格監(jiān)控溫度和露時(shí)，及時(shí)發(fā)布霜疫病發(fā)生流行的預(yù)警信息。

表2 模型參數(shù)估計(jì)1)Table 2 Parameter estimates for the model

表3 模型檢驗(yàn)與擬合公式Table 3 Verification and fitting formula of model

圖3 荔枝霜疫霉侵染荔枝葉片和果實(shí)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖Fig. 3 Risk prediction charts for Peronophythora litchi infecting litchi leaf and fruit

3 討論與結(jié)論

溫度和濕度在病原孢子產(chǎn)生和病害的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用[17]。據(jù)報(bào)道，病原真菌孢子的近距離傳播在一定程度上依賴于局部的溫度和濕度[18]。近年來，多用定量分析模型研究溫度和露時(shí)對(duì)病原菌孢子萌發(fā)侵染的影響。在卵菌病害的研究中，Arauz等[15]通過定量分析模型研究了溫度和露時(shí)對(duì)黃瓜霜霉病菌Pseudoperonospora cubensis孢子萌發(fā)和侵染的影響；Rakotonindraina等[19]則結(jié)合分析模型研究了不同氣象條件、土質(zhì)等外界因素影響下馬鈴薯晚疫病菌Phytophthora infestans對(duì)馬鈴薯的為害。在果園病害的研究中，Li等[20]定量研究了溫度和相對(duì)濕度對(duì)梨黑星病菌Venturia nashicola分生孢子萌發(fā)和侵染的影響。本研究在人工控溫、控濕條件下，定量分析了4組溫度 (15～30 ℃)、5 組露時(shí) (2～24 h)對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)和侵染的影響，利用SAS軟件構(gòu)建了以溫度和露時(shí)為自變量的函數(shù)。并在此基礎(chǔ)上，制得荔枝霜疫霉侵染嫩葉和成熟果實(shí)相對(duì)應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖。在卵菌侵染葉片的試驗(yàn)中，Neufeld等[14]研究認(rèn)為病害嚴(yán)重度不大于0.1時(shí)，為輕度發(fā)病，病害嚴(yán)重度為0.1～0.2時(shí)屬于中度發(fā)病，不小于0.2則為重度發(fā)病。參考此標(biāo)準(zhǔn)，本研究認(rèn)為霜疫霉侵染荔枝嫩葉時(shí)，當(dāng)溫度為 22～30 ℃、露時(shí)為 3～24 h 時(shí)，葉片的病害嚴(yán)重度達(dá)到0.2以上，認(rèn)定為嫩葉發(fā)病嚴(yán)重，應(yīng)及時(shí)防治。孢子囊為害成熟果實(shí)則更加迅速和嚴(yán)重，當(dāng)溫度為 15～30 ℃、露時(shí)約 2～3 h 時(shí)，果實(shí)的病害嚴(yán)重度即高達(dá)0.6，足可為害成災(zāi)。

本研究獲得的荔枝霜疫霉侵染荔枝嫩葉和成熟果實(shí)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖可為實(shí)際生產(chǎn)中的荔枝霜疫病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供參考，但仍存在不足，例如在構(gòu)建模型后，使用SAS PROC REG過程分析孢子囊萌發(fā)率和寄主發(fā)病嚴(yán)重度觀察值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)性，認(rèn)為預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值無差異，模型擬合效果較好。模型的準(zhǔn)確性，還要結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際中病害發(fā)生流行期的溫度和露時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。