楊振興，寇美玲，李占鴻，廖德芳，肖 雷，朱建波，高 林，李華春，楊 恒

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224)

流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease，EHD)是由EHD 病毒(EHDV)感染反芻動(dòng)物引起的一種蟲(chóng)媒病毒病。EHDV 通過(guò)庫(kù)蠓叮咬反芻動(dòng)物進(jìn)行傳播，可感染包括黃牛、水牛、綿羊、山羊、鹿以及美洲羊駝在內(nèi)的多種反芻動(dòng)物[1]。該病對(duì)鹿和牛的危害最為嚴(yán)重，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔潰爛出血、呼吸道疾病和組織器官壞死，妊娠期母牛出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)，奶牛產(chǎn)奶量急劇減少[2-3]。EHD主要流行于北緯49 度至南緯35 度之間的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，疫病的暴發(fā)給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了畜產(chǎn)品的正常國(guó)際貿(mào)易，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病[4]。

EHDV 為呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)成員，基因組約 20 kb，由 10 個(gè)節(jié)段(Seg-1～Seg-10)雙鏈RNA 組成，可編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和 4 種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a)[5]。病毒的外層衣殼蛋白VP2 由基因節(jié)段Seg-2 編碼，Seg-2/VP2 序列具有高度的遺傳多樣性。VP2 蛋白主要介導(dǎo)病毒對(duì)細(xì)胞表面受體的特異性吸附，參與病毒粒子從感染細(xì)胞中的釋放，誘導(dǎo)感染動(dòng)物產(chǎn)生EHDV 特異性中和抗體，決定著病毒的血清型[6]。病毒內(nèi)層衣殼蛋白VP3 由基因節(jié)段Seg-3編碼，盡管VP3 高度保守，但其編碼基因Seg-3 在不同地域分離的病毒株間卻存在一定差異，可據(jù)此將EHDV 分為東方(Eastern)型與西方(Western)型兩種地域型(Topotype)以及多種地域亞型(Sub-topotype)[7]。

目前世界范圍共發(fā)現(xiàn)9 種血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4～EHDV-10)。早期分離的EHDV-3型(NIG/1967-1 株)通過(guò) Seg-2 基因測(cè)序，確認(rèn)為EHDV-1 型，EHDV-9 型于2013 年從南非羊駝中分離(GenBank 中尚無(wú)該病毒株的序列報(bào)道)，EHDV-10 型首次在日本發(fā)現(xiàn)[8]。本研究團(tuán)隊(duì)前期在全國(guó)范圍進(jìn)行EHDV 的血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國(guó)存在多種血清型EHDV：廣西主要存在EHDV-5～EHDV-8 的流行，并分離到EHDV-5 型病毒株；廣東有EHDV-1與EHDV-5 型的流行，分離到EHDV-1 型病毒株；內(nèi)蒙古則存在EHDV-6 型的流行，但未分離到病毒；云南主要有EHDV-1、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-10 的流行，并分離到 EHDV-1、EHDV-5、EHDV-7 和EHDV-10 型病毒株[9-12]。值得注意的是，在我國(guó)的南方與北方地區(qū)均檢測(cè)到EHDV-6 型特異性中和抗體，提示該血清型病毒在我國(guó)廣泛流行。

EHDV-6 型呈世界范圍分布：亞洲的日本，中東地區(qū)的土耳其、以色列與巴林，大洋洲的澳大利亞，北美洲的美國(guó)，非洲的南非、突尼斯、阿爾及利亞、摩洛哥，加勒比海的Martinique Island、Guadeloupe Island (法國(guó)海外省)，印度洋西部的Reunion Island(法國(guó)海外省)均有EHDV-6 型的分離報(bào)道[13-14]。我國(guó)雖然在廣西、內(nèi)蒙古與云南的哨兵動(dòng)物監(jiān)測(cè)到EHDV-6 型的特異性中和抗體，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)EHDV-6 型的分離報(bào)道。本研究首次報(bào)道了EHDV-6 型在我國(guó)云南省的分離與鑒定，為我國(guó)開(kāi)展EHDV 遺傳特性、致病性和病原檢測(cè)等方面奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 磁珠法病毒RNA 抽提試劑盒、新生牛血清和MEM 培養(yǎng)基均購(gòu)自Thermo 公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自NEB 公司；病毒RNA/DNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、PrimeScritp 逆轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA 聚合酶、pMD19-T 載體、E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自 TaKaRa 公司。BHK-21 細(xì)胞(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)保存；EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5～EHDV-8 型參考病毒由澳大利亞麥克阿瑟·伊麗莎白農(nóng)業(yè)研究所提供；上述參考病毒的陽(yáng)性血清，由本實(shí)驗(yàn)室采用純化滅活處理后的各血清型EHDV 參考病毒免疫日本大耳兔制備，血清中和抗體效價(jià)分別為：1∶453(EHDV-1)、1∶320(EHDV-2)、1∶226 (EHDV-5)、1∶453(EHDV-6)、1∶320 (EHDV-7)和 1∶640 (EHDV-8)。

1.2 監(jiān)控群的建立及血液樣品的采集 根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)牛羊蟲(chóng)媒病毒血清學(xué)調(diào)查結(jié)果，本研究在云南省師宗縣(經(jīng)度：E104°17'，N24°36'，海拔 940 m)設(shè)立牛羊蟲(chóng)媒病毒監(jiān)控點(diǎn)，采用放養(yǎng)的方式設(shè)置EHDV 血清抗體和核酸檢測(cè)均為陰性的10 頭牛與5頭山羊作為哨兵動(dòng)物。每年5 月～12 月定期采集哨兵動(dòng)物肝素鈉、EDTA 抗凝血和全血樣品于4 ℃冰盒保存，2012 年共采集上述樣品1 078 份，由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)與病毒分離工作。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中登錄的EHDV 株序列(LC320035、LC320036)，利用 Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)2 對(duì)引物分別用于擴(kuò)增EHDV-6 型病毒Seg-2 與Seg-3 基因序列(表1)，引物由上海捷瑞公司合成。

表1 EHDV-6 型Seg-2 與Seg-3 基因擴(kuò)增引物信息Table 1 Primer information of Seg-2 and Seg-3 of EHDV-6

1.4 EHDV 抗體和核酸的檢測(cè) 利用本實(shí)驗(yàn)室制備的EHDV 群特異性競(jìng)爭(zhēng)ELISA (C-ELISA)抗體檢測(cè)試劑盒[15]，對(duì)監(jiān)控點(diǎn)采集的哨兵動(dòng)物血清樣品進(jìn)行EHDV 群特異性抗體檢測(cè)；利用磁珠法病毒RNA 抽提試劑盒提取哨兵動(dòng)物EDTA 抗凝血樣品的核酸，采用本實(shí)驗(yàn)室建立的蟲(chóng)媒病毒高通量qRT-PCR 方法[16]檢測(cè)EHDV 的核酸。

1.5 病毒的分離與鑒定 對(duì)qRT-PCR 檢測(cè)為EHDV陽(yáng)性的血液樣本(Ct 值＜38)進(jìn)行病毒分離：取1 mL肝素鈉抗凝血離心并收集紅細(xì)胞(RBCs)，洗滌RBCs 2 次，加入滅菌水震蕩充分裂解RBCs 后接種于生長(zhǎng)為單層的BHK-21 細(xì)胞，并連續(xù)盲傳4 代以上，提取第4 代出現(xiàn)CPE 細(xì)胞的核酸，進(jìn)行EHDV的群特異性qRT-PCR 檢測(cè)[16]。

1.6 病毒粒子觀察 將1.5 分離到的病毒接種BHK-21 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，待其出現(xiàn)60 %～70 % CPE后刮下細(xì)胞，8 ℃3 500 r/min 離心30 min 棄上清，沉淀用PBS 懸浮后，超聲波處理3 次，12 000 r/min離心2 min，取上清液滴加在覆有Formver 膜的銅網(wǎng)上，約3 min 后，將銅網(wǎng)放入2 %磷鎢酸(pH7.2)中負(fù)染5 min，室溫風(fēng)干后經(jīng)透射電鏡觀察病毒粒子結(jié)構(gòu)特征。

1.7 哨兵動(dòng)物血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定 采用Karber 法測(cè)定分離病毒的TCID50，并進(jìn)行血清中和試驗(yàn)：1.取2 號(hào)哨兵牛EHDV 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)前后共5 周(8 月 11 日、8 月 25 日、9 月 1 日、9 月 8 日和 9 月15 日)血清與分離病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)；2.取實(shí)驗(yàn)室制備的6 種血清型EHDV 陽(yáng)性血清與分離病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)。試驗(yàn)方法如下：將血清10 倍倍比稀釋后加入細(xì)胞培養(yǎng)板(50 μL/ 孔)，加入 100 TICD50的病毒懸液(50 μL/孔)，充分混勻后 37 ℃ 5 % CO2條件下孵育 1 h，加入 BHK-21 細(xì)胞懸液(100 μL/孔)，37 ℃5 % CO2條件下培養(yǎng)7 d。逐日觀察CPE，初步判定分離病毒的血清型(抗體效價(jià)＜1:16 判定為陰性，1∶16≤抗體效價(jià) ＜1∶45 判定為可疑，抗體效價(jià)≥1∶45 判定為陽(yáng)性)。若待檢病毒被某型陽(yáng)性血清中和，則使用該血清型的標(biāo)準(zhǔn)參考病毒與分離到該病毒的動(dòng)物血清再次進(jìn)行中和試驗(yàn)，并計(jì)算血清中和抗體效價(jià)。

1.8 分離病毒Seg-2 與Seg-3 基因的PCR 擴(kuò)增與序列分析 使用病毒RNA/DNA 提取試劑盒提取培養(yǎng)第4 代病毒的核酸，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，使用(表1)中的引物分別進(jìn)行EHDV Seg-2與Seg-3 基因的PCR 擴(kuò)增。同時(shí)以BHK-21 細(xì)胞核酸為陰性對(duì)照，澳大利亞EHDV-6 型(HEDV-6/AUS,AM74508E)病毒株核酸為陽(yáng)性對(duì)照， PCR 產(chǎn)物回收純化后克隆至pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化后，將PCR 鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌落經(jīng)測(cè)序鑒定。使用MEGA 6.0軟件[17]對(duì)測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析，并采用鄰近法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建 Seg-2 與 Seg-3 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.9 哨兵牛的EHDV 抗體水平和病毒核酸檢測(cè)取被EHDV 感染的2 號(hào)哨兵牛5 月～12 月每周采集的血液樣本，分別提取核酸和分離血清后進(jìn)行EHDV的群特異性 qRT-PCR 檢測(cè)[16]和抗體 C-ELISA 檢測(cè)[15]，分析該病毒株在宿主動(dòng)物體內(nèi)的感染特性。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離鑒定結(jié)果 采用EHDV 群特異性qRT-PCR 和C-ELISA 對(duì)師宗監(jiān)控點(diǎn)采集的哨兵動(dòng)物血液和血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示8 月25 日采集的2 號(hào)哨兵牛血液的EHDV 核酸呈陽(yáng)性和血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)(血清抗體抑制率為65.27 %)，表明該動(dòng)物感染了EHDV。取其抗凝血接種BHK-21 細(xì)胞盲傳4 代，細(xì)胞在接種3 d 后開(kāi)始出現(xiàn)部分變圓并皺縮，6 d 后基本全部變圓脫落崩解。提取病變細(xì)胞核酸進(jìn)行EHDV qRT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示EHDV 核酸拷貝數(shù)為2.67×108拷貝/μL，表明從2 號(hào)哨兵牛血液中分離出EHDV，并命名為YNSZ/V003/2012。

2.2 病毒形態(tài)的電鏡觀察結(jié)果 將經(jīng)BHK-21 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的病毒株YNSZ/V003/2012 處理后經(jīng)透射電鏡觀察，結(jié)果顯示病毒形態(tài)呈球形，無(wú)囊膜，直徑60 nm～80 nm，可以清晰觀察到病毒衣殼表面分布著大量纖維狀突起，與文獻(xiàn)報(bào)道的環(huán)狀病毒屬病毒形態(tài)特征一致(圖1)，表明分離的病毒粒子形態(tài)完整，并再一次證明分離到了EHDV。

圖1 YNSZ/V003/2012 的透射電鏡觀察Fig.1 Negative staining electron microscopy observation of YNSZ/V003/2012 virions

2.3 哨兵動(dòng)物血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 經(jīng)Karber 法測(cè)定分離病毒YNSZ/V003/2012 株的TCID50為106.3/mL。取2 號(hào)哨兵牛EHDV 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)前后共5周的血清樣本與分離的病毒進(jìn)行血清中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示 8 月 11 日、8 月 25 日、9 月 1 日、9 月 8 日和 9 月 15 日其抗體效價(jià)分別為≤1∶7、1∶28、1∶80、1∶160 和 1∶226，表明哨兵牛產(chǎn)生了針對(duì) YNSZ/V003/2012 株的特異性中和抗體，且抗體水平隨著時(shí)間的推移逐步升高，因此可確認(rèn)YNSZ/V003/2012 株感染了2 號(hào)哨兵牛。

取不同血清型的EHDV 陽(yáng)性血清與100 TCID50的YNSZ/V003/2012 株病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-7 與 EHDV-8型陽(yáng)性血清對(duì)病毒均無(wú)中和作用，而EHDV-6 型陽(yáng)性血清對(duì)病毒的中和效價(jià)為1:160 (表2)，表明分離的病毒為EHDV-6 型。取2 號(hào)哨兵牛8 月11 日、9月 8 日和 9 月 15 日血清，以 100 TCID50的 EHDV-6/AUS 進(jìn)行血清中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示該哨兵動(dòng)物的血清對(duì) EHDV-6/AUS 株的中和效價(jià)分別為≤1∶7、1∶113和1∶160，進(jìn)一步表明2 號(hào)哨兵牛產(chǎn)生了針對(duì)EHDV-6型的特異性中和抗體。

表2 哨兵牛感染EHDV 血清型的中和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Serotype neutralization test results of the sentinel infected with EHDV

2.4 分離病毒Seg-2 與Seg-3 基因的PCR 擴(kuò)增與序列分析結(jié)果 以分離病毒的cDNA 為模板，對(duì)病毒 Seg-2 和 Seg-3 基因進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出大小分別約為900 bp 和1 000 bp，與預(yù)期相符(圖2)。經(jīng)測(cè)序和BLAST 分析比對(duì)，表明正確克隆了YNSZ/V003/2012 病毒株的 Seg-2 與 Seg-3基因。

2.5 分離病毒Seg-2 序列與系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析結(jié)果分離病毒Seg-2 基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，病毒株YNSZ/V003/2012 與日本病毒株[3](LC320035_EHDV6_Japan_2015)的地域型同屬東方型，并形成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支(圖3)，其Seg-2 基因序列和VP2 氨基酸序列與日本病毒株的相似度分別為99.2%和99.4 %。病毒株YNSZ/V003/2012 與其它EHDV-6型東方型病毒株基因序列相似度在88.6 %～89.6 %之間，氨基酸序列相似度在92.7 %～93.8 %之間，表明YNSZ/V003/2012 株與日本EHDV-6 型病毒株的Seg-2/VP2 親緣關(guān)系最近。

圖2 YNSZ/V003/2012 株 Seg-2 與 Seg-3 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplication of Seg-2 and Seg-3 of YNSZ/V003/2012 isolate by RT-PCR

圖3 YNSZ/V003/2012 病毒株Seg-2 基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)圖Fig.3 Phylogenetic alnalysis of Seg-2 gene of YNSZ/V003/2012 isolate

2.6 分離病毒Seg-3 序列與系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析結(jié)果分離病毒Seg-3 序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)顯示，與Seg-2 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)一致，病毒株YNSZ/V003/2012 與日本EHDV-6 病毒株的Seg-3 聚為一簇，二者Seg-3 基因與氨基酸序列相似度分別為98.9 %與99.8 %；與EHDV 其它東方型病毒株基因序列相度為92.2 %～96.2 %，氨基酸序列相似度為99.4 %～99.8 %；與EHDV 西方型病毒株的基因序列相似度為79.8 %～80.4 %，氨基酸序列相似度為96.2 %～96.7 % (圖4)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明YNSZ/V003/2012 與日本EHDV-6 病毒株親緣關(guān)系最近。

圖4 YNSZ/V003/2012 株Seg-3 基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)圖Fig.4 Phylogenetic analysis of Seg-3 gene of YNSZ/V003/2012 isolate

2.7 哨兵牛EHDV 抗體和核酸檢測(cè)結(jié)果 為明確病毒株YNSZ/V003/2012 的感染特性，分別采用C-ELISA 和 qRT-PCR 方法對(duì) 2 號(hào)哨兵牛 5 月～12 月采集血液中的血清抗體與病毒核酸進(jìn)行監(jiān)測(cè)。C-ELISA 結(jié)果顯示8 月25 日該哨兵牛EHDV 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，血清抗體抑制率從感染病毒前一周(8 月11 日)的27.25 %升高至65.27 %，隨后血清抗體抑制率繼續(xù)升高，在9 月8 日達(dá)到82.8%，以后均維持在80%以上。qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在動(dòng)物血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)的8 月25 日，血液樣品中檢測(cè)到EHDV 核酸，并且核酸含量最高(Ct 值最低為29.9)，隨后的7 周，血液中病毒含量持續(xù)減少(Ct 值逐漸升高)，7 周后血液樣品核酸Ct 值大于38 并判定為陰性(圖5)。表明病毒株YNSZ/V003/2012 感染動(dòng)物后病毒能夠在短時(shí)間內(nèi)快速?gòu)?fù)制增殖，隨后動(dòng)物體內(nèi)抗體水平迅速升高，抑制病毒增殖的能力增強(qiáng)，病毒含量逐漸減少直至檢測(cè)不到。

3 討 論

圖5 哨兵牛血清EHDV 抗體C-ELISA 和血液qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The results of EHDV C-ELISA of serum and qRT-PCR of blood in sentinel cattle

本研究從云南師宗分離到一株牛源EHDV 株，命名為 YNSZ/V003/2012， 對(duì)其進(jìn)行群特異性RT-PCR 檢測(cè)，病毒粒子電鏡觀察，血清中和試驗(yàn)及Seg-2 與Seg-3 序列分析，確定分離到的病毒株為EHDV-6 型，為云南首次報(bào)道的EHDV-6 型病毒株。云南省屬低緯度高原地區(qū)，地理位置特殊，地況地貌復(fù)雜，氣候類型豐富多樣，具有適合各類吸血節(jié)肢動(dòng)物生存繁殖的環(huán)境條件，有利于蟲(chóng)媒病毒在媒介昆蟲(chóng)和動(dòng)物宿主之間的傳播循環(huán)，因此蟲(chóng)媒病毒種類眾多[18-19]。本實(shí)驗(yàn)室在云南分離到了EHDV-1、EHDV-5、EHDV-7、EHDV-10 等血清型病毒株[12]，但EHDV-6 型尚屬首次分離，表明我國(guó)云南省流行EHDV 的多樣性。EHDV-6 型病毒在以色列、土耳其和巴林等中東地區(qū)曾多次引起疫病暴發(fā)和流行[13]，特別是2015 年其在日本牛群中引起了疫病的暴發(fā)[3]，這提示我國(guó)很可能也面臨EHDV-6 型引起的疫病威脅。因此為更好的保護(hù)我國(guó)畜牧業(yè)的健康發(fā)展，今后還需加強(qiáng)對(duì)我國(guó)EHDV-6 型的監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步掌握該血清型病毒在我國(guó)的分布和遺傳特征，為疫病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

由于EHDV 不同血清型病毒株之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，所以掌握某一地區(qū)流行EHDV 的血清型與遺傳背景，分析病毒可能的來(lái)源，對(duì)EHD 防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。通過(guò)對(duì)分離的YNSZ/V003/2012 病毒株Seg-2、Seg-3 序列比對(duì)和進(jìn)化分析，顯示不同血清型EHDV 分布在A～D 4 個(gè)群[6]，目前世界范圍內(nèi)分離的EHDV-6 型病毒株均分布在B 群，并可分為東方型與西方型兩種地域型。中國(guó)、日本、澳大利亞、美國(guó)與法國(guó)的海外行政區(qū)(瓜德羅普島與馬提尼克島)分離的EHDV-6 型病毒株均屬東方型。

該分離病毒株的Seg-2/VP2 和Seg-3/VP3 序列與日本EHDV-6 型病毒株的親緣關(guān)系最近，基因與氨基酸序列相似度分別高達(dá)99.2 %/99.4 %和98.9 %/99.8 %，表明二者可能在進(jìn)化上有著最近的共有祖先。云南和日本在地理位置上相距十分遙遠(yuǎn)，為什么我國(guó)云南省與日本分離的EHDV-6 型病毒株顯示如此近的親緣關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。本研究在下一步的工作中將完成我國(guó)EHDV-6 型病毒株的全基因組測(cè)序工作，進(jìn)而在全基因組層面分析中國(guó)與日本EHDV-6 型病毒株之間的關(guān)系。

本研究對(duì) 2 號(hào)哨兵牛 2012 年 5 月～12 月的EHDV-6 型感染情況進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，將2 號(hào)哨兵牛全年的 EHDV 陽(yáng)性核酸抗凝血(8 份)均接種BHK-21 細(xì)胞，但僅8 月25 日的血液樣品分離到病毒。推測(cè)病毒株YNSZ/V003/2012 感染動(dòng)物后，血清中抗體水平迅速升高，抗體與病毒結(jié)合抑制了血液中病毒對(duì)BHK-21 細(xì)胞的感染所致。該結(jié)果提示選擇好病毒分離時(shí)間點(diǎn)對(duì)病毒的成功分離非常重要。對(duì)2 號(hào)哨兵牛血液中EHDV 核酸動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果顯示，YNSZ/V003/2012 病毒感染動(dòng)物后，動(dòng)物血液中的病毒核酸含量隨時(shí)間推移快速降低，在感染7 周后已經(jīng)完全檢測(cè)不到EHDV 核酸，表明病毒在牛體內(nèi)呈現(xiàn)一過(guò)性感染，也可能部分解釋了該病毒株未能引起哨兵牛出現(xiàn)臨床癥狀的原因。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展YNSZ/V003/2012 病毒株的流行病學(xué)調(diào)查與致病性等提供了參考依據(jù)。