張志強(qiáng) ，蘇碩青，杜萬年，李永慧，劉勃興，吳同壘，朱國強(qiáng)，史秋梅*

(1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066004；2.秦皇島第二醫(yī)院，河北昌黎066600；3.揚州大學(xué)，江蘇揚州225009)

細(xì)菌生物被膜(Biofilm，BF)是細(xì)菌在生長過程中粘附于其表面形成的多成分聚集物，是由細(xì)菌分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白、DNA 等將菌體包裹而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[1]。BF 作為有效的物理屏障，能夠協(xié)助病原菌抵御藥物和免疫系統(tǒng)殺傷，對細(xì)菌的生存十分重要。沙門菌在生長和感染過程中也能于多種附著物表面產(chǎn)生BF，這對于其在不利環(huán)境下生存乃至造成長期持續(xù)性感染具有重要的意義[2]。已有文獻(xiàn)表明，BF 態(tài)沙門菌感染致病能力遠(yuǎn)高于游離態(tài)細(xì)菌[3]。影響細(xì)菌BF 的因素十分復(fù)雜，培養(yǎng)條件、定植區(qū)域、菌體密度等均可影響B(tài)F 形成[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白與細(xì)菌BF 密切相關(guān)，將某些外膜蛋白，如OmpR[4]、OmpP1[5]等缺失能夠顯著影響細(xì)菌BF 生成。

OmpD (又名NmpC)是沙門菌外膜孔蛋白，在所有孔蛋白中含量最多。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中OmpD的表達(dá)量受到細(xì)菌培養(yǎng)條件的影響，缺氧、pH 變化以及氧化應(yīng)激條件均可引起該蛋白表達(dá)變化[6]。在鼠傷寒沙門菌的研究中發(fā)現(xiàn)，OmpD 還參與細(xì)菌對巨噬細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞的粘附和侵襲，在感染的起始階段發(fā)揮重要作用[7]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)OmpD 是沙門菌誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子，具有作為亞單位疫苗的潛力[8]。作為沙門菌表達(dá)量最多的孔蛋白，OmpD 與細(xì)菌BF 的相關(guān)性尚未見報道。本研究擬以沙門菌OmpD 蛋白作為研究對象，通過構(gòu)建腸炎沙門菌ompD基因缺失株研究其生物學(xué)特性，探究OmpD 與沙門菌BF、耐藥性以及致病力等的相關(guān)性，為沙門菌的致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑 質(zhì)粒pKD3、pKD46、pCP20 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)康元環(huán)教授惠贈；人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2、腸炎沙門菌參考菌株C50336、質(zhì)粒pBR322 由揚州大學(xué)朱國強(qiáng)教授惠贈。昆明鼠購北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

細(xì)菌RNA 提取試劑盒、基因組清除試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；LATaqDNA 聚合酶、細(xì)菌基因組提取試劑盒、dNTP、限制性內(nèi)切酶及T4 連接酶均購自TaKaRa 公司；剛果紅、考馬斯亮藍(lán)、熒光增白劑和L- 阿拉伯糖購自Sigma 公司；瓊脂糖DNA 回收試劑盒購自Tiangen 公司。

1.2 λ-Red 同源重組引物的設(shè)計 根據(jù)NCBI 中登錄的腸炎沙門菌基因組序列(CP023475.1)設(shè)計引物(表1)，P1/P2 用于擴(kuò)增打靶片段，由兩部分組成，5' 端加下劃線的部分與待敲除基因序列同源，3' 端未加下劃線部分與氯霉素抗性基因cat兩側(cè)序列互補(bǔ)，P3/P4 引物用于構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒；P5/P6 引物位于ompD基因開放閱讀框外側(cè)，用于缺失株的鑒定；P7/P8 為RT-qPCR 引物，位于ompD基因缺失片段內(nèi)部，用于缺失株的鑒定。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 沙門菌ompD基因缺失株及回補(bǔ)菌株的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[9]，利用λ-Red 同源重組方法對ompD基因進(jìn)行敲除，最終得到ompD基因缺失菌株C50336ΔompD，對該菌株利用PCR(P5/P6)和RT-qPCR(P7/P8)方法進(jìn)行鑒定。

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取C50336 菌株基因組，以基因組為模板，利用P3/P4 引物擴(kuò)增ompD基因片段，將其克隆至pBR322 質(zhì)粒，構(gòu)建pBR322-ompD質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至C50336ΔompD菌株，構(gòu)建回補(bǔ)菌株pBR322-ompD/C50336ΔompD，并進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 沙門菌生長特性檢測 分別將菌株C50336、C50336ΔompD、 pBR322-ompD/C50336ΔompD接 種LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日按1:50 轉(zhuǎn)接新鮮LB 或M9 培養(yǎng)基，37 ℃同步振搖培養(yǎng)；每隔2 h 吸取菌液樣品，測定其吸光度OD600nm值，繪制不同菌株的生長曲線。

1.5 腸炎沙門菌BF 形成能力檢測 參照文獻(xiàn)[3]，分別采用試管法和96 孔微量法檢測上述各菌株BF形成能力。為分析BF 成分，將各菌株接種至剛果紅培養(yǎng)基(含剛果紅40 μg/mL，考馬斯亮藍(lán)G250 20 μg/mL)，30 ℃培養(yǎng) 48 h，通過觀察菌落形態(tài)、顏色分析BF 成分；同時將各菌株接種含有熒光劑(熒光增白劑28 終濃度為200 μg/mL)的培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，在366 nm 紫外線下比較菌落熒光強(qiáng)弱，分析BF 纖維素的含量。

1.6 菌株耐藥性檢測 參照CLSI 試驗標(biāo)準(zhǔn)，利用K-B 紙片法對上述腸炎沙門菌3 個菌株進(jìn)行抗生素敏感性測試，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，統(tǒng)計各抗生素藥敏紙片所形成的抑菌圈直徑。參照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)，測定腸炎沙門菌各菌株對多黏菌素B 的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)。

1.7 細(xì)菌粘附試驗 參照文獻(xiàn)[3]，分別測定上述腸炎沙門菌3 個菌株對人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2 粘附能力。計算細(xì)菌粘附率(粘附細(xì)胞菌數(shù)/ 初始菌數(shù)×100 %)。試驗均重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)利用prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 細(xì)菌致病力的檢測 參照文獻(xiàn)[3]方法，利用昆明鼠模型測定上述腸炎沙門菌各菌株對其的半數(shù)致死量(LD50)，以評估各菌株對小鼠的致病力。

1.9 BF 和毒力基因的檢測 參照文獻(xiàn)[10]，利用RT-qPCR 方法檢測上述腸炎沙門菌3 個菌株BF 調(diào)控基因csgA、csgD、bcsA、ompR、adrA和毒力基因fimD、sdiA、flgG、invH、rpoS的轉(zhuǎn)錄水平，所用引物分別來源于文獻(xiàn)[10]和[11]。

2 結(jié) 果

2.1 腸炎沙門菌C50336ΔompD的構(gòu)建 利用同源重組方法缺失腸炎沙門菌C50336 菌株ompD基因，對獲得的一次重組菌株(C50336ΔompD::cat)和二次重組菌株(C50336ΔompD)進(jìn)行PCR(P5/P6)檢測。結(jié)果顯示，對照野生型菌株擴(kuò)增片段約為1 700 bp，一次重組菌株和二次重組菌株擴(kuò)增片段分別約為1 800 bp和900 bp (圖1)，與預(yù)期大小一致；對二次重組菌株P(guān)CR (P5/P6)產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，經(jīng)過兩次重組得到的C50336ΔompD菌株基因組中已不含ompD基因片段；RT-qPCR (P7/P8)結(jié)果顯示未檢測到ompD基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(圖略)。上述結(jié)果表明正確構(gòu)建了腸炎沙門菌缺失菌株C50336ΔompD。同時，利用引物P3/P4 進(jìn)行菌液PCR 鑒定回補(bǔ)株，結(jié)果顯示回補(bǔ)株正確構(gòu)建(圖略)。

圖1 腸炎沙門菌ompD 基因缺失株的PCR 鑒定Fig.1 Identification of the knockout of ompD gene in Salmonella enteritidis strains by PCR

2.2ompD基因缺失對腸炎沙門菌生長特性的影響分別繪制腸炎沙門菌3 種菌株在LB 和M9 培養(yǎng)基中的生長曲線，結(jié)果顯示，3 株菌生長速度在這兩種培養(yǎng)基中均無明顯差異(圖2)。表明ompD基因的缺失對腸炎沙門菌生長速率無影響。

碾壓混凝土因其具有施工速度快的優(yōu)點得到了廣泛應(yīng)用。近年來，大型碾壓混凝土大壩施工中，碾壓混凝土日澆筑上萬立方已較為普遍。即使是在小型碾壓混凝土壩施工中，碾壓混凝土的日澆筑方量通常也能達(dá)到一千立方以上。一般情況下，只有混凝土拌和系統(tǒng)的生產(chǎn)能力足夠高的情況下，碾壓混凝土的施工強(qiáng)度可以是同等條件下常態(tài)混凝土施工強(qiáng)度的3倍以上。

2.3ompD基因缺失對腸炎沙門菌BF 的影響 利用試管法和96 孔微量法檢測腸炎沙門菌3 種菌株BF 形成情況。結(jié)果顯示，C50336ΔompD株在試管氣液交界處形成的BF 明顯少于野生型菌株和回補(bǔ)菌株(圖3A)；定量檢測結(jié)果顯示，相對于野生型菌株，C50336ΔompD株 BF 減少了近 75 % (圖3B)，表明ompD基因缺失能夠降低腸炎沙門BF 的形成。

進(jìn)一步將腸炎沙門菌3 種菌株接種剛果紅瓊脂，觀察各菌落的形態(tài)及顏色。結(jié)果顯示，野生型菌株和回補(bǔ)菌株均能夠在剛果紅培養(yǎng)基上形成粗糙的帶有明顯褶皺的紅色菌落，而缺失菌株C50336ΔompD所形成的菌落較為光滑(圖3C)，表明ompD基因缺失能夠降低腸炎沙門BF 關(guān)鍵成分卷毛蛋白的合成。

進(jìn)一步將腸炎沙門菌3 種菌株接種含熒光增白劑瓊脂，在紫外線下觀察菌落熒光情況，結(jié)果顯示，缺失菌株C50336ΔompD菌落熒光強(qiáng)度略低于野生型菌株和回補(bǔ)菌株(圖3D)，表明ompD基因缺失能夠降低腸炎沙門BF 重要成分纖維素的合成。

圖2 腸炎沙門菌生長曲線的測定結(jié)果Fig.2 Growth characteristics of C50336 isogenic deletion strains

2.4ompD基因缺失對腸炎沙門菌耐藥性的影響利用K-B 紙片法分析腸炎沙門菌3 種菌株的耐藥情況，結(jié)果顯示，相對野生型菌株和回補(bǔ)菌株，在涂布缺失菌株C50336ΔompD平板上各藥敏紙片形成抑菌圈直徑明顯增大(表2)，表明ompD基因缺失會引起腸炎沙門菌對多種抗生素的敏感性增強(qiáng)。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)ompD基因缺失也會造成腸炎沙門菌對多肽類抗生素多粘菌素B 的敏感性增強(qiáng)，其對多粘菌素 B 的 MIC 由 16 μg/mL 下降至4 μg/mL，表明OmpD 可能參與腸炎沙門菌感染中應(yīng)對體內(nèi)抗菌肽的殺傷。

圖3 腸炎沙門菌BF 形成及成分分析Fig.3 Determination of biofilm formation and its components in the C50336 isogenic deletion strains

2.5ompD基因缺失對腸炎沙門菌黏附的影響 檢測腸炎沙門菌3 種菌株對人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2 細(xì)胞的黏附能力。結(jié)果顯示，與野生型菌株和回補(bǔ)菌株相比，基因缺失菌株C50336ΔompD對Caco-2 細(xì)胞的黏附能力無顯著差異(圖4，p＞0.05)，表明OmpD不影響腸炎沙門菌對細(xì)胞的粘附。

2.6ompD基因缺失對腸炎沙門菌毒力的影響 利用小鼠模型測定腸炎沙門菌3 種菌株的LD50，結(jié)果顯示，野生型菌株、ompD基因缺失菌株和回補(bǔ)菌株的 LD50分別為 3.16×106cfu/ 只、6.3×107cfu/ 只和1.29×107cfu/ 只，相較于野生型菌株，基因缺失菌株C50336ΔompD對小鼠LD50提高了近20 倍，表明OmpD 影響腸炎沙門菌的毒力。

表2 腸炎沙門菌藥敏試驗結(jié)果Table 2 Antibotics sensitivity assay of C50336 isogenic deletion strains

圖4 腸炎沙門菌生物的黏附能力測定Fig.4 Adhesion assay of C50336 isogenic deletion strains

2.7ompD基因缺失對腸炎沙門菌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用RT-qRT 方法檢測腸炎沙門菌內(nèi)毒力基因轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示，相比野生型菌株和回補(bǔ)菌株，缺失菌株C50336ΔompD中參與腸炎沙門菌BF 調(diào)控基因csgA、csgD、ompR、adrA的轉(zhuǎn)錄水平均不同程度下調(diào)(圖5A)，其它毒力基因fimD、sdiA、flgG、invH和rpoS等轉(zhuǎn)錄水平也有不同程度下調(diào)(圖5B)，結(jié)果初步揭示OmpD 蛋白影響腸炎沙門菌的BF 形成以及參與毒力機(jī)制。

圖5 RT-qPCR 分析腸炎沙門菌各菌株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平情況Fig.5 Analysis of virulence gene expression of C50336 isogenic deletion strains by RT-qPCR

3 討 論

沙門菌能夠感染多種動物，對成年動物多造成隱性感染和持續(xù)性感染，感染持續(xù)時間可達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年，給該病防控造成重大困擾[12]。BF 有助于沙門菌應(yīng)對不利環(huán)境和應(yīng)激，對其體內(nèi)持續(xù)感染十分重要[1]。因此研究沙門菌BF 的形成機(jī)制和調(diào)控因素，對沙門菌病的防控具有指導(dǎo)意義。本研究主要圍繞沙門菌外膜孔蛋白OmpD與腸炎沙門菌BF 的關(guān)系進(jìn)行研究，探索該蛋白在沙門菌致病中的作用。

影響B(tài)F 形成的因素十分復(fù)雜，多種基因被報道在沙門菌BF 生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究中通過RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，與BF 相關(guān)的csgA、csgD、ompR、adrA[10,14]基因轉(zhuǎn)錄水平不同程度下調(diào)，確認(rèn)了OmpD 蛋白對腸炎沙門菌BF 的影響。

BF 是細(xì)菌的重要粘附因子，其主要成分卷毛蛋白參與細(xì)菌對宿主細(xì)胞的定植黏附以及細(xì)胞間的相互作用[15]，研究發(fā)現(xiàn)OmpD 蛋白在鼠傷寒沙門菌黏附細(xì)胞過程中發(fā)揮一定作用[16]，因此推測OmpD 與腸炎沙門菌粘附相關(guān)，然而本研究未觀察到腸炎沙門菌ompD基因缺失菌株黏附能力的顯著下降，其原因有待進(jìn)一步研究。

BF 能夠保護(hù)細(xì)菌免受外界不利環(huán)境的殺傷，與細(xì)菌的耐藥性密切相關(guān)[1]，已有研究發(fā)現(xiàn)OmpD 在鼠傷寒沙門菌對抗頭孢曲松鈉殺傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]；此外，作為細(xì)菌表達(dá)量最大的外膜孔蛋白，OmpD 一個重要功能是排出各種毒性物質(zhì)[16]，因此推測OmpD 參與細(xì)菌應(yīng)對多種殺菌物質(zhì)殺傷。本研究通過檢測腸炎沙門菌3 種菌株抗生素敏感性發(fā)現(xiàn)，ompD基因缺失能夠不同程度增加腸炎沙門菌對多種常用抗生素的敏感性。在眾多待檢抗生素中，多黏菌素B 是抗菌多肽類抗生素，其殺菌機(jī)制與宿主免疫系統(tǒng)分泌的抗菌肽相似，常作為機(jī)體抗菌肽的代表模型[18]。本研究ompD基因缺失菌株對多黏菌素B 的敏感性增強(qiáng)，MIC 提高了3 倍，表明OmpD 蛋白可能參與腸炎沙門菌應(yīng)對宿主抗菌肽的殺傷。

基于本研究確認(rèn)的OmpD 蛋白上述功能推測該蛋白可能參與腸炎沙門菌的致病過程。關(guān)于OmpD蛋白與細(xì)菌毒力關(guān)系還存在諸多爭議，Dorman 等通過測定LD50認(rèn)為ompD基因缺失能夠降低鼠傷寒沙門菌毒力[19]。而Mayer 等用小鼠模型分析認(rèn)為ompD基因缺失不會影響沙門菌毒力[20]。本研究利用昆明鼠模型分析腸炎沙門菌3 種菌株致病力，發(fā)現(xiàn)ompD基因缺失能夠降低腸炎沙門菌的毒力。此外，本研究還檢測到了ompD基因缺失所引起的一些毒力基因的變化，包括運動相關(guān)基因fimD、flgG，侵襲基因invH以及調(diào)控性基因sdiA、rpoS[10]，這些結(jié)果表明OmpD 蛋白可能參與腸炎沙門菌這些相關(guān)生理過程。

綜上所述，OmpD 蛋白參與腸炎沙門菌BF 形成和抗生素敏感性，與細(xì)菌致病性密切相關(guān)。