張花 楊濤 衡友強 王艷

摘?要：病程相關蛋白（PRs）在植物抗病抗逆過程中發(fā)揮重要作用。鹽穗木病程相關蛋白基因HcPR10（GenBank：KF673356）來自鹽穗木（Halostachys capsica）在600 mmol·L-1 NaCl脅迫下的鹽抑制差減文庫。為探究鹽穗木病程相關蛋白HcPR10發(fā)揮生物學功能的機制，該研究通過體外表達和純化HcPR10重組蛋白制備特異性的HcPR10多克隆抗體。并采用雙酶切構建原核重組表達載體pET28a-HcPR10，轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21誘導表達，通過正交分析優(yōu)化重組蛋白可溶性誘導表達的條件，利用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白，免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，基于純化獲得的His-HcPR10重組蛋白和轉HcPR10擬南芥總蛋白，分別利用ELISA和Western Blotting檢測抗血清效價和特異性。結果表明：成功構建重組表達載體pET28a-HcPR10;正交結果顯示誘導溫度27 ℃，誘導轉速200 r·min-1，IPTG濃度0.7 mmol·L-1，誘導時間6 h條件下可誘導表達大量可溶性目的蛋白;ELISA檢測抗HcPR10血清效價達1∶243 000，Western Blotting印跡結果顯示制備的抗血清可以與重組蛋白和轉基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）中異源表達的HcPR10蛋白特異性結合。該研究獲得了效價高、特異性強的鹽穗木病程相關蛋白HcPR10抗血清，為進一步研究HcPR10的亞細胞定位及生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞：鹽穗木病程相關蛋白HcPR10， 原核表達， 蛋白純化， 抗體制備及鑒定

中圖分類號：Q946.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）12-1732-08

Abstract：Pathogenesis-related proteins （PRs） play important roles in plants in response to pathogen attack and diverse environmental stresses. HcPR10 （GenBank：KF673356） was isolated from the Suppression Subtractive Hybridization cDNA libraries of Halostachys caspica under the stress of 600 mmol·L-1 NaCl. In order to investigate the biological function of HcPR10， the specific polyclonal antibody of HcPR10 was prepared by expression and purification of recombinant HcPR10 protein in vitro. In this study， recombinant prokaryotic expression vector pET28a-HcPR10 was constructed by double digestion and then was transformed into Escherichia coli strain BL21 to induce HcPR10 expression. We explored the optimal expression condition for soluble recombinant protein in BL21 by orthogonal analysis. Fusion proteins which were purified by the Ni-NTA affinity chromatography column were injected to BALB/c mice for preparing the HcPR10 polyclonal antibody. The titer and specificity of HcPR10 antiserum were detected respectively by ELISA and Western Blotting using recombinant protein His-HcPR10 and total protein of transgenic HcPR10 Arabidopsis thaliana. The results were as follows：The recombinant expression vector pET28a-HcPR10 was successfully constructed; The maximum amount of soluble fusion protein was obtained under the 27 ℃， 200 r·min-1 and 0.7 mmol·L-1 IPTG for induction 6 h; The antiserum for HcPR10 possessing 1∶243 000 titer could bind specifically to recombinant protein His-HcPR10 and the heterologous protein from transgenic HcPR10 Arabidopsis thaliana. The high titer and specific antiserum for HcPR10 has been prepared successfully， the results of this study provide the foundation for further investigating the subcellular localization and biological function of HcPR10.

Key words：pathogenesis-related protein 10 from Halostachys caspica （HcPR10）， prokaryotic expression， protein purification， antibody preparation and identification

病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）是植物受到生物或非生物脅迫時誘導表達的一類特異性蛋白，在植物疾病防御、響應生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用（溫韻潔等，2008）。病程相關蛋白廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中，根據(jù)它們的電泳遷移率、植物起源、血清學關系和氨基酸序列同源性，病程相關蛋白被分為17個家族，其中PR10因包含100多個成員而備受關注（Van et al.， 2006;Sels et al.， 2008）。

PR10首次在體外培養(yǎng)的歐芹（Petroselinum crispum）細胞中發(fā)現(xiàn)（Somssich et al.， 1988），之后又相繼鑒定了水稻（Oryza sativa）、甘蔗（Saccharum officinarum）、三七（Panax notoginseng）和鷹嘴豆（Cicer arietinum）的病程相關蛋白10（Wu et al.， 2016;Peng et al.， 2017;Tang et al.， 2019;Chatterjee et al.， 2019），其蛋白分子量在15～19 kDa之間，等電點偏酸性、無信號肽序列、屬胞內蛋白（Radauer et al.， 2008），是一類結構保守并發(fā)揮多種生物學功能的蛋白質（楊濤和王艷，2017）。過表達不同來源的PR10基因能夠顯著提高轉基因植株對多種病原體的抗性（Zandvakili et al.， 2017;Tang et al.， 2019），目前普遍認為RNase活性是PR10發(fā)揮生物脅迫抗性的關鍵（Peng et al.， 2017;Finkina et al.， 2017）。體外研究顯示具有RNase活性的煙草（Nicotiana tabacum）NtPR10對煙草赤星病菌（Alternaria alternata）具有抑菌活性（張玉等，2018）;過表達茉莉酸誘導的病程相關蛋白10（JIOsPR10）增強了水稻對稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的耐受性（Wu et al.， 2016）;玉米（Zea mays）ZmPR10也顯示出廣譜的抗真菌活性（Zandvakili et al.， 2017）。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)PR10基因也受鹽、干旱、寒冷等非生物因子的誘導，在植物非生物脅迫防御中同樣發(fā)揮重要作用。旱柳（Salix matsudana）SmPR10的過表達增加了擬南芥的鹽脅迫抗性，水稻RSOsPR10的過表達增強了水稻對干旱脅迫及剪股穎（Agrostis stolonifera）對干旱和鹽脅迫的耐受性（Takeuchi et al.， 2016;Han et al.， 2017;汪志星等，2018）。除具有抗病和抗逆功能外，近年研究發(fā)現(xiàn)來自麝香百合（Lilium longiflorum）的LlPR10、水稻JIOsPR10和水稻OsPR10A的過表達調節(jié)了植株的生長發(fā)育（Hsu et al.， 2014;Wu et al.， 2016;張彤等，2019）。雖然植物病程相關蛋白家族PR10已被廣泛研究，但其發(fā)揮作用的機制仍不清楚。

蛋白質功能的發(fā)揮與其在細胞中的位置密切相關（Scott et al.， 2005;He et al.， 2013），亞細胞定位是蛋白質功能研究的關鍵特征之一。目前，大部分PR10蛋白亞細胞定位的研究方法主要采用融合報告基因進行顯微觀察，例如，通過構建融合GFP表達載體，顯示辣椒（Capsicum annuum）PR10-LRR1復合物的細胞質定位是引發(fā)辣椒葉片細胞死亡的前提（Choi et al.， 2012）;鷹嘴豆CaABR18蛋白則是一個具有雙重作用模式的細胞核定位蛋白，其可通過增加真菌膜的通透性和核崩解從而發(fā)揮抗真菌活性（Chatterjee et al.， 2019）。此外，采用免疫膠體金技術顯示華東葡萄（Vitis pseudoreticulata）VpPR10.2蛋白分布在葉綠體和細胞壁，從而發(fā)揮其酶活性并抵抗病原體的早期入侵（He et al.， 2013）。以上結果表明不同PR10蛋白定位于不同細胞器，進而通過不同的機制發(fā)揮生物學功能。

鹽穗木是新疆鹽堿環(huán)境分布最廣泛的建群種和優(yōu)勢種，是鹽生植物的先鋒代表，有著極強的生命力（郗金標等，2006;Zeng et al.， 2015）。HcPR10（GenBank：KF673356）是鹽穗木中的一個鹽響應基因，前期研究發(fā)現(xiàn)該基因受到各種非生物脅迫誘導且可顯著提高轉基因植物的耐鹽和耐旱性（文章未發(fā)表），但對其參與生物學功能的機制仍不清楚。PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）在線預測顯示鹽穗木病程相關蛋白HcPR10可能定位表達在線粒體基質、細胞質和過氧化物酶體等亞細胞水平的結構中。因此，本研究通過構建原核表達載體pET28a-HcPR10，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達并純化融合蛋白His-HcPR10，免疫小鼠，制備效價高、特異性強的鹽穗木病程相關蛋白HcPR10的多克隆抗體，為HcPR10的組織和細胞定位及生物學功能研究奠定基礎。

1?材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實驗材料?擬南芥為Columbia-0（Col-0）生態(tài)型，本小組前期通過農桿菌（Agrobacterium）介導的花序浸染法獲得了轉HcPR10擬南芥OE1和OE9兩個純系植株。大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司，DH5α-pET28a（+）和DH5α-pMD18-T-HcPR10為本實驗室保存菌種。

1.1.2 試劑?限制性內切酶Hind Ⅲ、Eco RⅠ、Taq酶及T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司。蛋白和DNA Marker均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;BCA法和Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE電泳各項試劑均為北京賽馳生物科技有限公司產品;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司;DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;其他常用試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體pET28a-HcPR10的構建?根據(jù)本實驗前期克隆獲得的鹽穗木病程相關蛋白HcPR10基因序列（GenBank登錄號：KF673356），分別設計上游含Eco RⅠ、下游含Hind Ⅲ限制性內切酶位點的引物，上游引物HcPR10 EP1：5′-cggGAATTCATGGGTGTATTTACAT-3′;下游引物HcPR10 HP2：5′-tgtAAGCTTTCAAGCATAAAGCTG

AGG-3′（下劃線表示相應的酶切位點，小寫字母為保護堿基）。以pMD18-T-HcPR10質粒為模板，進行PCR擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。HcPR10 PCR產物和pET28a表達載體雙酶切后回收，T4連接酶16 ℃過夜連接，將連接產物轉化DH5α菌株，獲得的重組質粒pET28a-HcPR10經雙酶切鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白的原核表達、優(yōu)化及純化?將測序正確的重組質粒pET28a-HcPR10轉化大腸桿菌BL21，按照張冀等（2018）的方法誘導表達目的蛋白，將誘前、誘后、誘后上清和誘后沉淀于4 ℃，12 000 r·min-1，離心2 min，各取20 SymbolmA@

L點樣，用15% SDS-PAGE檢測。以可溶性融合蛋白占總蛋白含量的百分比為依據(jù)，對誘導的IPTG濃度（0.4、0.7、1.0 mmol·L-1）、溫度（27、31、37 ℃）、轉速（180、200、220 r·min-1）和時間（4、5、6 h）進行4因素3水平正交試驗（表1），設計正交分析表（表2），分析這4個因素對HcPR10重組蛋白可溶性的影響，優(yōu)化表達體系。對正交實驗9組不同條件下誘導的蛋白進行SDS-PAGE電泳，并通過ImageJ對電泳條帶進行灰度掃描，確定HcPR10原核誘導表達的最佳條件。在最佳誘導條件下表達重組蛋白His-HcPR10，收集菌體，超聲破碎，8 000 r·min-1，離心10 min收集上清，上鎳柱純化蛋白，然后用200 mmol·L-1的咪唑洗脫，SDS-PAGE檢測洗脫蛋白，用索萊寶公司BCA蛋白定量試劑盒進行定量，分裝置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 抗血清的制備?以純化的His-HcPR10融合蛋白為抗原，采集免疫前BALB/c小鼠血清為陰性對照。取50 μg抗原與等體積弗氏完全佐劑乳化，采用腹腔注射法對小鼠進行初次免疫，并分別在第10天、第29天、第33天用等體積弗氏不完全佐劑乳化的目的蛋白加強免疫，每只50 μg劑量。第4次免疫4 d后采用眼部取血法采血，將收集的血清37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，5 000 r·min-1，離心15 min分離血清，于-80 ℃保存。

1.2.4 多克隆抗體的效價檢測?以純化的His-HcPR10融合蛋白為抗原每孔加1 μg包被ELISA板，4 ℃過夜，用TTBS洗滌3次，每次10 min，用200 μL 1% BSA封閉液37 ℃封閉1 h。先加入用1% BSA封閉液梯度稀釋的免疫前和免疫后血清（每孔100 μL），37 ℃孵育1 h，用TTBS洗滌3次，每次3 min，再加入1∶1 000的HRP標記的山羊抗小鼠IGg二抗，37 ℃孵育1 h，用TTBS洗滌4次，每次3 min，最后以TMB為底物進行顯色，待呈現(xiàn)梯度藍色后每孔加入50 μL 2 mol·L-1的H2SO4終止反應，檢測450 nm波長下的吸光度。免疫前血清為對照，免疫前后A450值分別為N和P，以P/N>2.1為標準判斷血清有效效價。

1.2.5 Western Blotting檢測?以營養(yǎng)土中生長4周齡的擬南芥為材料，按照Koteyeva et al.（2011）所述的方法提取植物總蛋白，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。分別取10 μg His-HcPR10重組蛋白和10 μg擬南芥植株總蛋白，經15% SDS-PAGE分離后轉印至NC膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST 4 ℃過夜封閉，用1∶1 500（v/v）一抗，37 ℃孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min;加入1∶2 000（v/v）的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3次，每次10 min，洗滌后DAB顯色。

2?結果與分析

2.1 原核表達載體pET28a-HcPR10的構建及鑒定

提取構建獲得的重組質粒pET28a-HcPR10，采用Eco RⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切鑒定，經1%瓊脂糖凝膠電泳獲得了與預期486 bp大小相符的目的基因片段和載體片段（圖1），測序結果正確，表明原核表達載體pET28a-HcPR10構建成功。

2.2 重組蛋白HcPR10的原核表達條件優(yōu)化及純化

2.2.1 重組蛋白HcPR10的原核表達?將重組質粒pET28a-HcPR10轉化到大腸桿菌BL21中，隨機挑取4個BL21-pET28a-HcPR10單克隆，在0.7 mmol·L-1 IPTG、37 ℃誘導溫度、220 r·min-1誘導轉速下進行4 h初步誘導表達，SDS-PAGE電泳結果顯示，與誘導前相比，經IPTG誘導后4個單克隆均在約25 kDa處誘導出一條增強的蛋白條帶（圖2：A），且單克隆間無表達量的差異，表明該蛋白在BL21大腸桿菌中成功表達。對誘導后的蛋白進行超聲破碎，用15% SDS-PAGE檢測誘導前、誘導后、誘導后上清、誘導后沉淀樣品，結果表明重組蛋白HcPR10以可溶性和包涵體兩種形式存在（圖2：B）。

2.2.2 重組蛋白HcPR10的原核表達優(yōu)化及純化?為獲得大量可溶性HcPR10重組蛋白，對正交實驗9組不同條件下誘導表達的蛋白超聲并進行SDS-PAGE檢測，使用ImageJ對條帶進行灰度掃描，進行含量計算和統(tǒng)計學分析（圖3），根據(jù)數(shù)據(jù)顯示可知，9組正交實驗中第8組的可溶性蛋白含量最低，第4組的可溶性蛋白含量最高，約為第8組的3.5倍，因此，BL21-pET28a-HcPR10菌種在IPTG濃度0.7 mmol·L-1、溫度27 ℃、轉速200 r·min-1下誘導6 h時表達的可溶性HcPR10重組蛋白量最大。在最優(yōu)條件下對含有pET28a-HcPR10重組質粒的菌種進行大量表達，收集大腸桿菌菌體，超聲破碎，離心取上清液，用組氨酸標簽親和層析柱對上清液中的融合蛋白進行純化，對誘導前、誘導后、誘導后上清、誘導后沉淀、純化的His-HcPR10蛋白進行SDS-PAGE檢測，結果顯示在最優(yōu)條件下誘導表達后，誘導的目的蛋白大部分以可溶性形式存在，并在純化后得到分子量大小約為25 kDa的目的重組蛋白HcPR10（圖4）。以BCA蛋白定量試劑盒測得純化蛋白濃度為500 μg·mL-1。

2.3 多克隆抗體的免疫效價及特異性分析

采用間接ELISA法檢測抗血清效價。將抗血清用1%BSA封閉液按1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000、1∶27 000、1∶81 000、1∶243 000稀釋后進行測定，結果如圖5：A所示。由圖5可知，當抗血清稀釋243 000倍時，小鼠抗血清的光吸收值與陰性對照相比大于2.1，即抗血清效價達1∶243 000，表明該抗血清滴度較高。以純化的His-HcPR10重組蛋白、野生型及兩個轉HcPR10基因擬南芥植株總蛋白為樣品進行Western Blotting鑒定，結果顯示純化的重組蛋白在約25 kDa處出現(xiàn)了一條雜交條帶（圖5：B），兩個轉HcPR10基因擬南芥株系總蛋白在約18 kDa（圖5：C）處均出現(xiàn)了與預期分子量大小一致的特異性雜交條帶，而野生型擬南芥總蛋白沒有出現(xiàn)雜交條帶，說明制備的HcPR10抗血清不僅能與重組的His-HcPR10蛋白結合，而且也能夠特異地識別擬南芥中異源表達的HcPR10蛋白。效價高、特異性強的His-HcPR10融合蛋白抗血清制備成功。

3?討論與結論

高效的蛋白表達系統(tǒng)是研究蛋白結構、定位及功能的基礎。本研究的核心目的是純化目的蛋白，制備效價高、特異性好的鹽穗木病程相關蛋白HcPR10的抗血清。大腸桿菌是最常用的原核表達系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、遺傳穩(wěn)定、表達量高、成本低廉、表達產物易純化及使用范圍廣等優(yōu)點（Nuc & Nuc， 2006）。此外，本研究選擇pET28a作為表達載體，不僅由于其含有高表達目的蛋白的噬菌體T7啟動子，且其N端和C端各有一個可編碼6個連續(xù)His的標簽，方便后續(xù)融合蛋白的純化。本試驗將構建成功的鹽穗木重組表達載體pET28a-HcPR10導入大腸桿菌BL21中誘導表達，誘導后的蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在，影響了蛋白的大量獲得及后續(xù)純化工作的開展。誘導溫度、IPTG濃度、誘導時間和誘導轉速是影響原核表達及蛋白可溶性的主要因素，正交試驗設計可減少試驗次數(shù)和縮短試驗周期，并能明確各因素對試驗結果的影響是否顯著以及各因素的交互作用，常被用于多因素多水平的最優(yōu)搭配探索（溫耀安等，2014）。本試驗采用正交設計對原核誘導表達條件進行優(yōu)化，最終確定在溫度27 ℃、IPTG 0.7 mmol·L-1、時間6 h、轉速200 r·min-1時，融合蛋白HcPR10在大腸桿菌內的可溶性含量最高，從而增加了HcPR10重組蛋白的數(shù)量和純化效率，有助于蛋白純化及多克隆抗體的制備。趙樂等（2015）選擇pET32a作為表達載體，采用控制變量法對誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度及誘導起始宿主菌密度這4個因素對蛋白表達的影響研究發(fā)現(xiàn)，誘導溫度30 ℃、IPTG濃度0.4 mmol·L-1、起始宿主菌密度A600為0.8、誘導時間8 h為蛋白可溶性表達的最佳條件。張玉等（2018）選擇pCold Ⅱ低溫表達載體對目的蛋白表達條件研究顯示，與37 ℃相比，15 ℃條件下融合蛋白表達量更大，可溶性更高。因此，推測蛋白誘導表達的最佳培養(yǎng)條件與所選擇的表達載體和目的蛋白自身的性質密切相關。

在最佳條件下誘導表達重組蛋白，用Ni2+親和層析獲得純化的目的蛋白，免疫小鼠獲得HcPR10抗血清，ELISA檢測結果顯示制備的HcPR10抗血清效價達1∶243 000。抗體對抗原蛋白的專一性是抗體應用的關鍵，本研究提取了野生型和轉HcPR10基因擬南芥中的總蛋白，通過Western Blotting鑒定HcPR10抗血清的特異性，結果兩個轉基因株系OE1、OE9在18 kDa附近均出現(xiàn)一條特異條帶，而野生型擬南芥總蛋白沒有出現(xiàn)雜交條帶，因此，制備的HcPR10抗血清具有高特異性。以上結果為利用該抗血清進一步研究HcPR10蛋白的組織和細胞定位及生物學功能奠定了基礎。

綜上所述，本研究成功構建了鹽穗木病程相關蛋白HcPR10的原核表達載體pET28a-HcPR10。通過4因素3水平正交試驗獲得了可溶性His-HcPR10重組蛋白表達的最優(yōu)誘導條件：溫度27 ℃、IPTG 0.7 mmol·L-1、時間6 h、轉速200 r·min-1，并純化獲得500 μg·mL-1的重組蛋白。制備的多克隆抗體效價達1∶243 000，Western Blotting檢測該血清能與轉基因植物中異源表達的HcPR10特異性結合，可用于HcPR10的亞細胞定位研究。

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（責任編輯?周翠鳴）