孫瀅 姜自鵬 劉洪泰 孫明銘 蔣彩虹 任民 劉旦 羅朝鵬 張劍鋒 楊軍 楊愛國 程立銳

摘要：煙草開花期影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，是決定生態(tài)適應(yīng)性和產(chǎn)量的重要性狀，與各種生物或非生物脅迫密切相關(guān)。研究煙草開花期的遺傳規(guī)律，進(jìn)而解析調(diào)控開花時(shí)間的分子基礎(chǔ)，對(duì)煙草品種改良具有重要意義。本研究選用煙草MAGIC（Multiparent Advanced Generation Intercrossing）群體為材料，利用高密度煙草SNP（Single Nucleotide Polymorphism）芯片進(jìn)行基因型分析，進(jìn)而對(duì)開花期性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）。結(jié)果表明，共檢測到13個(gè)與煙草開花期性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中位于12號(hào)染色體109616410bp位置上的SNP為最顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。根據(jù)參考基因組，初步確定了控制開花期的關(guān)鍵候選基因Mab02790610，該基因與擬南芥控制開花的關(guān)鍵基因SOC高度同源，可能在控制煙草開花時(shí)間上起到關(guān)鍵作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示煙草開花期遺傳調(diào)控機(jī)制及育種改良奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：單核苷酸多態(tài)性（SNP）：全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）;煙草;開花期

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)中具有十分重要的地位。作為茄科作物之一，其開花時(shí)間提前或延遲，不僅影響產(chǎn)品器官的產(chǎn)量和品質(zhì)，還與各種生物或非生物脅迫密切相關(guān)。

開花期作為重要的煙草農(nóng)藝性狀，屬于數(shù)量性狀，遺傳復(fù)雜，易受光周期、溫度等環(huán)境影響。普通煙草的一個(gè)野生親本林煙草為長日照植物，而另外一個(gè)野生親本絨毛狀煙草表現(xiàn)為短日照植物。其后代普通煙草大多數(shù)品種都為中性或者偏短日照。經(jīng)典的遺傳學(xué)研究表明，普通煙草的開花期受一對(duì)隱性基因控制。目前，關(guān)于煙草開花期遺傳機(jī)制的報(bào)道，主要集中在控制開花的關(guān)鍵基因以及基因與環(huán)境互作上。FT、SOC（suppressor of overexpression of constans 1）、AGL24（gamouslike24）和LFY（e/）等都是成花過程中重要的調(diào)控基因，其中，F(xiàn)T是決定是否成花的最關(guān)鍵基因，最早在擬南芥晚花突體中發(fā)現(xiàn)。HARING等在煙草中鑒定到4個(gè)Fr同源基因FT、MF2、NF73和NFT4，并證明其只受短日照條件影響。SMYKAL等從煙草中克隆到SOC，過表達(dá)煙草會(huì)提前開花。李元元等克隆獲得了MFLC全長序列，并分析了NC82品種移栽后不同時(shí)間進(jìn)行低溫處理該基因的表達(dá)特征，證明該基因與低溫敏感、早花特性有關(guān);白戈等從煙草中克隆了一個(gè)高度保守的MYB類啟動(dòng)子基因（NTMYB15），過表達(dá)該基因的煙草K326經(jīng)低溫脅迫出現(xiàn)晚花;楊永銀等發(fā)現(xiàn)，低溫會(huì)使抗壞血酸氧化酶（AO）表達(dá)水平增加，脫氫抗壞血酸（DHA）含量增加，而且DHA能誘導(dǎo)SOC1表達(dá)水平升高，使開花提前。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，在煙草上針對(duì)農(nóng)藝、抗性和品質(zhì)等重要性狀，利用關(guān)聯(lián)分析或連鎖分析方法進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)（QL）發(fā)掘和標(biāo)記開發(fā)研究已有多篇報(bào)道131，但是有關(guān)煙草開花期的遺傳定位研究報(bào)道很少。蔡長春等利用早花品種K326和遲花品種興煙1號(hào)組合的D群體和遺傳連鎖圖譜對(duì)煙草開花期進(jìn)行了初步的遺傳分析，檢測到2個(gè)主效QL位點(diǎn)，表型變異貢獻(xiàn)率分別為24.5%和17.3%。而針對(duì)煙草開花期的全基因組關(guān)聯(lián)分析未見報(bào)道。

本研究利用8個(gè)不同類型煙草種質(zhì)為親本組配的MAGIC群體為材料，對(duì)煙草開花期性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘與花期關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，預(yù)測候選基因，不僅為揭示煙草控制花期遺傳機(jī)制提高煙草適應(yīng)性提供理論基礎(chǔ)，也為煙草廣適性育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1試驗(yàn)材料供試群體由本研究組配置

Beinhart1000-1、Florida301、Samsun、Basma、紅花大金元、VAM、塘蓬和小花青等8個(gè)不同煙草類型種質(zhì)的雜交組合，進(jìn)而構(gòu)建了基于有限親本的高代互交系MAGIC群體（Multiparent Advanced Generation Inter-cross），群體材料有519個(gè)株系。

1.1.2試驗(yàn)地點(diǎn)2019年3月15日，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草硏究所諸城試驗(yàn)基地種植8個(gè)親本及MAGIC群體材料，行距60cm，株距為40cm，每材料種植1行10棵，2次重復(fù)。

1.2表型調(diào)查

以2019年3月15播種日期為T1，某株系內(nèi)50%植株中心花開放的日期為T2，T2與T1之間間隔的天數(shù)即為該株系的開花期。

1.3MAGIC群體基因型鑒定

2019年8月18日針對(duì)8個(gè)親本和MAGIC群體600個(gè)株系，選取株系內(nèi)長勢一致單株的鮮嫩葉片混合取樣，利用DNA提取試劑盒提取DNA。應(yīng)用高密度煙草SNP芯片（Gene Tian芯片，美國Affymetrix公司）對(duì)不同樣品進(jìn)行全基因組掃描。參照張劍鋒等的方法略有調(diào)整，進(jìn)行SNP芯片檢測。并對(duì)Poly high resolution類型的位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)處理和分析，共獲得在親本間具有多態(tài)性的高質(zhì)量SNP位點(diǎn)124153個(gè)，用于群體基因型分析。

1.4全基因組關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用TASSEL5.0軟件中的混合線性模型MLM（Mixed Linear Model）進(jìn)行性狀與標(biāo)記之間的全基因組關(guān)聯(lián)分析，以軟件給出的p值作為顯著關(guān)聯(lián)的閾值。當(dāng)標(biāo)記的p≤0.0001時(shí)，則認(rèn)為標(biāo)記與性狀之間存在關(guān)聯(lián)。

2結(jié)果

2.1表型變異及SNP標(biāo)記多態(tài)性

如圖1所示，煙草開花期在親本及群體中存在顯著差異。親本小花青和Samsun開花期較早，分別是132和133d;剩余6個(gè)親本Basma、VAM、紅花大金元、塘蓬、Beinhart1000-1、Florida301的開花時(shí)間很相近，分別在138、139、140、140、140.5、140.5d。供試群體開花期的最小值為124.5d，而最大值有152d，開花期的峰度和偏度的絕對(duì)值均小于1，說明開花期具有正態(tài)分布特征，呈現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳特征。

2.2花期與SNP的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）

采用TASSELV5.0軟件MLM模型，對(duì)519份MAGIC群體材料進(jìn)行開花期的全基因組關(guān)聯(lián)分析，如圖2、3所示。其中共檢測到13個(gè)與開花期顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)p《000）（表1），分別位于煙草第4、5、6、8、12、13、15、17、19號(hào)染色體上，根據(jù)值排序，在煙草全基因組染色體上的物理位置分別為：12號(hào)染色體，109616410bp;8號(hào)染色體，2266918bp8號(hào)染色體，135192920bp;17號(hào)染色體，43342018bp6號(hào)染色體，74138868p：4號(hào)染色體，35423572bp：4號(hào)染色體，91394779bp2號(hào)染色體，57703873bp：13號(hào)染色體，76563713bp：15號(hào)染色體，21104329bp;5號(hào)染色體，138720068bp;6號(hào)染色體，146052300bp：19號(hào)染色體，40502891bp其中，4、6、8號(hào)染色體分別檢測出2個(gè)顯著性位點(diǎn)，12號(hào)染色體上109616410bp處的SNP位點(diǎn)顯著性最高，p值為4.79;單個(gè)位點(diǎn)表型変異貢獻(xiàn)率（R）范圍為3.38～4.74%，其中最顯著位點(diǎn)的表型貢獻(xiàn)率為4.49%。

2.3預(yù)測候選基因

根據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，位于12號(hào)染色體上的SNP位點(diǎn)AX-117626364最可能與開花期性狀緊密關(guān)聯(lián)。

因此，以QFT1上下500kb區(qū)間范圍內(nèi)進(jìn)行候選基因篩選。如表2所示，目標(biāo)區(qū)間內(nèi)總共有19個(gè)編碼基因，注釋功能為細(xì)胞色素P450、突觸結(jié)合、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、羧酸酯酶活性MADS-box蛋白、溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶、木質(zhì)部絲氨酸蛋白酶、類草菌素蛋白酶、磷脂酶β1、過氧化物酶體生物發(fā)生蛋白等。其中Mab0279640和Mab0279620編碼與擬南芥MADS-box轉(zhuǎn)錄因子功能相似蛋白，控制著花器官形成、發(fā)育等重要生理過程1Mab0279630、Mab02790610和Mab0279600與擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的花卉整合子SOC1功能相似，調(diào)控上游CONSTANS基因（CO）影響開花時(shí)間2。其中Mab0279610距離最顯著的SNP位點(diǎn)的物理距離僅為32.11kb，因此初步將其確定為控制烤煙開花期關(guān)鍵候選基因。

3討論

3.1Magic群體

國際上早在2002年就已經(jīng)提出包含有8個(gè)親本的互交設(shè)計(jì)，又稱為多親本高世代互交（Multiparent Advanced Generation Inter-crossing，MAGIC）。2008年，CAVANAGEI等2向植物界引進(jìn)了多親本高代互交（Muli-parent advanced generation Inter-cross）群體，簡稱為MAGIC群體。

相比雙親群體和自然群體，MAGIC群體具有顯著優(yōu)勢。本研究中以8個(gè)優(yōu)質(zhì)特色品種構(gòu)建的煙草上第一套MAGIC群體，其中包含烤煙（紅花大金元）、晾曬煙（小花青、塘蓬）、香料煙（Samsun、Basma）、雪茄煙（Beinhart1000-1、Florida301）和白肋煙（VAM）。與自然群體相比，MAGC群體沒有群體結(jié)構(gòu)問題，避免了關(guān)聯(lián)分析結(jié)果出現(xiàn)假陽性。全基因組分析結(jié)果共有13個(gè)與花期顯著相關(guān)的位點(diǎn)，群體遺傳豐富性得到很好的體現(xiàn)參考煙草全基因功能注釋，由最顯著位點(diǎn)初步篩選到Mab0279610，該基因與擬南芥中控制開花關(guān)鍵基因SOC同源，也極大可能是控制烤煙開花時(shí)間的關(guān)鍵基因。由此看出，MAGIC群體的連續(xù)雜交，極大地提高了重組概率，加了定位的準(zhǔn)確性。

結(jié)果表明，MAGIC群體相比雙親群體和自然群體，不僅在數(shù)量性狀的關(guān)聯(lián)分析及精細(xì)定位方面等具有極大的優(yōu)勢，而且群體規(guī)模越大，定位越準(zhǔn)確?？偠灾?個(gè)不同種質(zhì)構(gòu)建的MAGIC群體既可以彌補(bǔ)雙親群體重組發(fā)生有限、作圖分辨率低的不足，又能控制群體結(jié)構(gòu)，非常適合當(dāng)前的遺傳和育種研究，是理想的遺傳和育種研究材料。

3.2SNP標(biāo)記

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標(biāo)記作為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記，包含有單堿基的轉(zhuǎn)換、顛倒、插入及缺失等多種形式，在基因組中具有遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多、分布廣、易于檢測等特點(diǎn)，適合于MAGIC群體的檢測分析，滿足全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)于大樣本高密度標(biāo)記的要求，可以大大提高關(guān)聯(lián)分析的統(tǒng)計(jì)效率。

基于SNP標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析所定位的QTL，在MAS中可提高選擇的目的性和準(zhǔn)確性，進(jìn)而提高育種效率，已成功應(yīng)用于人類2、果蠅等2多種生物的遺傳研究。但是在煙草中目前報(bào)道的關(guān)聯(lián)分析研究大多采用SSR標(biāo)記27-，分析群體的分子標(biāo)記數(shù)目一般小于300個(gè)，如此少的標(biāo)記數(shù)目很難實(shí)現(xiàn)全基因組分析。本研究利用高密度SNP芯片對(duì)MAGIC群體進(jìn)行分析，總共獲得了124153個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)，多態(tài)性標(biāo)記覆蓋了煙草整個(gè)基因組，為開展煙草重要性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析定了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.3SOCI

利用MAGIC群體和高密度SNP分子標(biāo)記，我門對(duì)控制開花的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果表明，距離最顯著的SNP位點(diǎn)32.113kb位置上有個(gè)與擬南芥SOC基因同源的基因。植 物經(jīng)過長期的發(fā)育進(jìn)化，形成了一套復(fù)雜而精細(xì)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以確保植株能在最佳時(shí)間開花。MADS-box蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在控制植物開花時(shí)間、花器官形成等方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用SOC1作為一個(gè)集成多個(gè)開花信號(hào)的整合子，已經(jīng)被深入研究了十幾年。SOC1作為一個(gè)MADS轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在控制植物開花時(shí)間、花器官形成和分生組織特異性等方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用，是構(gòu)成花卉時(shí)序和花卉發(fā)育基礎(chǔ)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要樞紐。因此，根據(jù)我們的定位結(jié)果及候選基因分析，將Nab0279610初步確定為候選基因，相關(guān)功能驗(yàn)證正在開展中。

4結(jié)論

利用8個(gè)不同類型煙草種質(zhì)為親本構(gòu)建了煙草MAGIC群體，結(jié)合124153個(gè)SNP標(biāo)記，進(jìn)行基因型分型結(jié)果和全基因組關(guān)聯(lián)分析，共挖掘到10個(gè)與煙草花期相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（p《0.0001）。根據(jù)煙草全基因組數(shù)據(jù)庫，初步將基因ab0279610確定為控制烤姻開花時(shí)間的關(guān)鍵候選基因，為進(jìn)一步開展煙草開花期分子機(jī)制研究及分子育種奠定了基礎(chǔ)。

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