韋春 秦利軍

摘要：為了解鉀和油菜素內(nèi)酯（BRs）在調(diào)控植物抗逆境脅迫中的作用，以超量表達K吸收基因NSAKT及BRs合成基因AIDF4的轉基因煙草為材料，分析PEG滲透脅迫對其形態(tài)及抗性指標等的影響。結果表明，PEG脅迫3d時，轉基因煙草SOD活性即達到極值且顯著高于非轉基因煙草（Wt），其中以共轉AKTI/DWE4植株中SOD活性最高;而PG脅迫1d時，3種轉基因植株的POD活性均顯著（《005）高于Wt植株，且共轉AKTIDWF4植株中POD活性分別是單轉AKT植株的1.28倍、單轉DF4植株的1.40倍和W植株的1.90倍PEG脅迫第3天時，共轉AKTDF4植株中CAT活性增幅最大，達59.18%，顯著高于其他2種轉基因煙草。同時，H2O2和MDA含量定表明，PEG處理后Wt中MDA和HO2含量均在第5天時達極值，分別為58.52nong和38.21gg，均顯著高于轉基因煙草。另外，特征基因表達分析表明，NsAK和ATDWFE4可能協(xié)同調(diào)控共轉1KTI/DWF4煙株對PEG滲透脅迫的抗性。本研究為進一步揭示K和BRs協(xié)同介導的煙草抗逆境脅迫應答機制以及創(chuàng)制優(yōu)良的煙草新種質(zhì)奠定理論依據(jù)。

關鍵詞：煙草;AKT：DF4;抗旱性

鉀不僅能維持植物細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡和控制氣孔開閉，還能改善煙草制品的安全性。環(huán)境中K主要是通過質(zhì)膜上的K通道（potassium channel，PC）進入植物體內(nèi)4。PC根據(jù)結構和功能不同，又可分為Shaker家族通道、KCO家族通道和其他通道。鉀轉運蛋白1（Arabidopsis-ike e potassium transporter，AKT）是Shaker家族中的K鉀離子通道，能在低K環(huán)境（10 umol/L）中促進植物吸收K79。在水稻（Oryza sativa）中，OSAKTI既能調(diào)節(jié)水稻在鹽脅迫下對K的吸收，又能提高水稻對干旱脅迫的抗性。

近年來，植物激素（plant hormones）介導的非生物脅迫抗性也被廣泛報道。其中，油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BRs）作為一種重要的甾醇類激素，參與了細胞分化、維管束發(fā)育及植物抗逆等過程1。蕓苔素內(nèi)酯（brassinolide，BL）作為BRs的活性形式，其生物合成已被證明至少需要經(jīng)由3條途徑，而DF4是催化這3條途徑的關鍵限速酶718。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，該酶與擬南芥類固醇羥化酶（Constitutive photomorphogenesis and dwarfism，CPD）具有43%的同源性。研究發(fā)現(xiàn)，超量表達DIF4不僅能增加油菜（Brassica napus）種子產(chǎn)量和對小球腔菌（Leptosphaeria maculans）和菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性，還能有效改善擬南芥和番茄（Solanum lycopersicum）的營養(yǎng)生理狀態(tài)盡管OSAKT1和DF4兩者單獨調(diào)控植物發(fā)育及抗性較多，但鮮有對兩者協(xié)同介導的非生物脅迫應答進行報道，本試驗立足于提高煙葉中鉀素含量和改善煙葉品質(zhì)，研究兩者間協(xié)同促進轉基因植株對滲透脅迫的抗性，以期為培育鉀含量高、抗旱能力強的煙草新種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

普通煙草（Nicotiana tabacum）品種K326，植物表達載體pRI201-35SAKTI、pRI201-rdDw4和pRI201-35SAKTI/rddwfa4均由貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存、構建并提供。植物激素及抗生素購于Sigma-Aldrich公司;植物表達載體pRI201-AN購于Takara公司;普通質(zhì)粒小提試劑盒及新型植物DNA提取試劑盒均購于TIANGEN BIOTECH公司;Multiscribe M Reverse Transcriptase Kit n POWERSYBRGreen PCR Master MixKit均購自Applied Biosystems公司物對F-35Sakt/R-Akthsp和F-IddwfR-Dwfhsp及Real-timePCR分析相關引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1載體構建以購自Takara公司的植物表達載體pRI201-AN（Code No.3264）為起始載體，利用Ne和SalI對其進行雙酶切，同時以這2個酶雙酶切人工合成的、兩端含有NeI和SalI酶切位點的NSAKTI基因序列。分別膠回收上述兩種酶切產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物依次經(jīng)T4DNA連接酶連接和酶切驗證后，構建植物表達載體pRI201-35 Saktl（圖1A）。利用KpI和Nor對植物表達載體pRI201-35Aktl進行雙酶切：利用KpI和NorI對植物表達載體pRI20-AN（Code No.3264）進行雙酶切，同時以這2個酶雙酶切人工合成的、兩端含有KpnI和NorI酶切位點的ATDWF4基因表達元件。ADF4基因表達元件由A.thaliana rd29A基因啟動子、A.thaliana DWF4基因及A.Thaliana HSP基因終止序列3部分組成。分別膠回收上述兩種酶切產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物依次經(jīng)T4DNA連接酶連接和酶切驗證后，構建植物表達體pRI201-rddwf（圖1B）。以構建的pRI201-35 SAKTI為中間載體，利用KmI和NoI將ADWF4基因表達元件從植物表達載體pRI201-rdDw4切下并連接入pRI201-35Aktl中并最終構建構建植物表達載體pRI201-35 SAKTI/rddw4（圖1C）。

1.2.2煙草轉化及轉基因植株鑒定參照農(nóng)杄菌轉化法2，以含3個質(zhì)粒的工程農(nóng)杄菌分別對栽培煙草K326進行遺傳轉化，按照譚穎等2的方法對侵染的葉塊進行后續(xù)培養(yǎng)。提取抗性煙株總基因組并以其為模板，用特異性引物F-201（-GACGGCCAGTGCCAAGCTTG-3）/R-AKT（5'-CCACACATAGAAACTCCTAAAACTCC-3）FAF-rd（5_GGGCCAATAGACATGGACCGACTAC-3R-DWF（5-CCGAGTGTTGTGGCGGTGTAC-3）對抗性植株進行PCR鑒定。F-201R-Akt引物擴條件為4℃2min：94C，30s，58C，40s，72C，1min，30個循環(huán)：72℃，5min：4℃維持。F-Rd/R-Dwf引物擴增條件為：94℃，2min94℃，20s，60℃0s，72℃，1min，28個循環(huán)：72℃，5min：4℃維持。

1.2.3轉基因煙草PEG滲透脅迫處理以穩(wěn)定遺傳的T1代轉基因煙草和同批繁殖的非轉基因煙草（K326）為材料，在16h光照/28℃，8h黑暗/23℃條件下萌發(fā)生長，待煙苗長至6～8葉期時，移栽至花盆（盆高18cm，直徑15cm，每盆裝培養(yǎng)基質(zhì)5kg），置于溫度為（252）℃，濕度70%，光照為1800x，光周期為16h光照/8h黑暗的人工培養(yǎng)箱中恢復培養(yǎng)5d。參照張祎等2的方法以20%PEG-6000溶液處理K326及轉基因煙苗，分別取PEG-6000處理前（0d）及處理1、3和5d的相同部位（自下向上第4葉）煙葉1g，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，用于測定煙葉中的抗氧化酶antioxidant enzymes，AOEs）活性;同時取PEG-6000脅迫處理前（0d）及處理6、12和24h的相同部位（自下向上第5葉）葉片1g，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，用于煙葉中K吸收及BRs合成相關基因表達分析。設3個生物學重復。

1.2.4MDA及H2O2含量測定以PEG-6000處理前（0d）及處理1、3和5d的葉片為材料，參照南京建成生物工程研究所丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA法，A003-1-2）及H2O2測定試劑盒（比色法，A064-1-1）方法制備待測樣，分別于532和405mm波長下測定吸光值，計算MDA和H2O2含量。每組設3個生物學重復。

1.2.5AOEs活性測定參照南京建成生物工程研究所POD（比色法，A084-3-1）、SOD（WST-1法，A001-3-2）和CAT（可見光法，A007-1-1）酶活力測定試劑盒說明書操作制備待測樣，待測樣分別在420、550和405m波長下吸光值，計算POD、SOD和CAT酶活力。每組設3個生物學重復。

1.2.6K吸收及BR合成相關基因表達分析分別取PEG脅迫處理前（0h）和脅迫6、12和24h的轉基因與非轉基因煙草相同部位葉片組織0.1g，按照OMEGA Plant RNA Kit試劑盒說明提取總RNA，并按Applied Biosystems，反轉錄操作將RNA反轉錄為cDNA。使用美國ABI7500實時熒光定量PCR儀檢測轉基因煙株葉片中K吸收相關基因，如HAK1、AKT1、NP1和TORKI以及BRs合成相關基因（DF4、DET2、CPD和RO73）的相對表達量，以煙草B-Acin作為內(nèi)參基因（表1），每個樣品設3個重復。

1.2.7數(shù)據(jù)處理采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，Duncan法分析其差異顯著性。

2結果

2.1植物表達載體的構建及酶切驗證

構建了以CaMV35S啟動子驅動N.sylvestrisAKT表達（CaM35：NSAKT）的植物表達載體pRI201-35 SAKTI，以A.haliana rd294基因啟動子啟動A.thaliana DWF4基因（ATDWF4）表達（r29A：AIDF4）的植物表達載體pRI201-rddwfe4和同時含有上述兩個表達元件（CaM/：NSAKT1和r29A：ATDWF4）的植物表達載體pRI201-35SAKTI/Rddwft4。pR201-35SAkt1經(jīng)NleI/SaI雙酶切可產(chǎn)生2682bp和10432bp兩條帶（圖2A）;pRI201-rdidwf4經(jīng)Kpn I/NotI雙酶切可產(chǎn)生2552bp和10432bp兩條帶（圖2B）pRI201-35SAkt-rddwf4經(jīng)NdeNotI雙酶切后可產(chǎn)生5484bp和10182bp兩條帶（圖2C）。說明目標片段已經(jīng)整合到質(zhì)粒載體中。

2.2轉基因煙株獲得及PCR鑒定

分別以含有pRI201-35SAkl、pRI201-rddwf4以及pRI201-35SAKTI-rddwfe4質(zhì)粒的工程農(nóng)桿菌對K326葉片進行遺傳轉化，經(jīng)一系列培養(yǎng)后獲得抗性植株（圖3A）。剪取抗性煙株葉片0.1g提取總DNA，以特異性引物F-201R-Akt對轉pRI201-35SAk載體的煙株進行鑒定，可擴增產(chǎn)生993bp大小的特異性條帶（圖3B）：以引物F-RdR-Dwf對轉pRI201-rddwf載體的煙株進行鑒定，可擴增產(chǎn)生554bp大小的特異性條帶（圖3C）而共轉植株可同時擴增到993bp和54bp兩條特異帶（圖3D）。最終，鑒定到單轉NSAKT植株56株，單轉ADF4植株42株，共轉NSAKTIATDWF4植株38株。

2.3PEG脅迫對轉基因煙草生長的影響

PEG脅迫試驗表明，3～5葉期轉基因和非轉基因（W）植株經(jīng)PG脅迫3d后，單轉ATDWF4植株（Dw）和單轉NSAKT7植株（Ak）均出現(xiàn)了不同程度的萎蔫，而共轉NSAKTILATDWF4的煙株（AkDw）僅少數(shù)葉片出現(xiàn)萎蔫，Wt葉片完全萎蔫、變黃（圖4A）：68葉期的轉基因煙苗對PG脅迫均表現(xiàn)出一定的抗性，但在脅迫處理10d時，單轉植株（Ak和Dw）的萎蔫程度顯著高于AkDw植株，而W植株在處理10d時葉片（完展葉和心葉）完全萎蔫，且下部葉片為焦枯色（圖4B），說明無論是3～5葉期的小煙苗，還是68葉期的大煙苗，AkDw植株都表現(xiàn)出較強的耐旱性?？梢姽厕DNSAKTIATDWF4植株耐旱性高于單轉AIDF4植株，高于單轉NSAKT植株。

2.4PEG脅迫對不同煙株理化指標的影響

2.4.1PEG脅迫對MDA及H2O2含量的影響由圖5可以看出，PEG脅迫處理前，轉基因和非轉基因煙株MDA含量差異不顯著。在脅迫1～5d時，非轉基因煙草MDA含量始終顯著高于轉基因煙草說明PEG脅迫可引起非轉基因煙株MDA的顯著積累。在PEG處理第5天時，AkDw植株MDA含量顯著低于Ak植株、Dw植株和W植株，表明其在應答PEG滲透脅迫時，AkDw植株能更有效地降低脂膜氧化產(chǎn)物MDA的積累，進而保護植物細胞。在PEG脅迫處理前，Dw植株H2O2含量顯著低于其他3種植株，但PEG滲透脅迫1d時，Dw煙草中的H2O2迅速積累且幅僅次于Ak/D植株。在PEG滲透脅迫1d時，轉基因植株中H2O2含量增幅均顯著高于非轉基因植株。脅迫處理3d和5d，非轉基因煙草中H2O2含量始終顯著（《005）高于轉基因植株。在PEG滲透脅迫5d時，除Ak/Dw植株H2O2含量降低外，Ak和W植株H2O2含量增幅均高于D植株。這一現(xiàn)象說明，不同轉基因植株應答PEG滲透脅迫時引起植物體積累H2O2的能力不同，進而反映出植株所受H2O2氧化程度也各異。

2.4.2PEG脅迫對AOEs活性的影響脅迫處理前，轉基因與非轉基因植株AOEs活性無顯著差異（圖6）。在脅迫3d時，轉基因煙草的SOD活性均顯著高于非轉基因煙草，其中以共轉AKT/DF4煙株的最高，達44.28U，其次是單轉DWF4植株，為40.45U。同時，在PEG處理第3天時，單轉DWF4和共轉AKTI/DF4煙株的POD活性達到極值，分別為338.16和384.37U。4種煙草株系CAT活性總體上表現(xiàn)為持續(xù)加的變化趨勢，但幅有一定差異。在PEG脅迫處理第3天時，共轉AKTIDWF4植株CAT活性増幅最大，較脅迫處理1d時增加59.18%，其余2種轉基因植株CAT活性增幅也較非轉基因植株顯著。以上結果表明，轉基因植株能有效并迅速地提高AOEs的活性來消除由于PEG滲透脅迫引起的H2O2、O2·等超氧化物的積累，且不同轉基因植株表現(xiàn)出調(diào)動AOEs活性存在一定差異。

2.5PEG脅迫煙草植株K吸收及BR合成基因表的影響

2.5.1K吸收相關基因表達由圖7可見，在PEG滲透脅迫24h內(nèi)，Ak、Dw和AkDw植株HAK基因表達量不斷增加，但以Dw植株增幅最為顯著。AKT基因在Ak和AkDw植株也呈逐步上升趨勢，且ー直顯著高于Dw和Wt植株，這可能與AKT在Ak和AkDw植株中的超量表達有關。在PEG滲透脅迫6h時，轉基因煙株中P表達量顯著高于W植株，隨著脅迫時間的增加，僅AkDw植株中的NPl表達量始終顯著高于W植株。TROKI在轉基因植株中表達変化與HAK基本相似，但表達量增幅有一定差異，以Ak植株最高，Ak/Dw其次，Dw植株最低。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PEG滲透脅迫不僅誘導Dw植株AK基因的表達上調(diào)，同時也引起Ak和Ak/Dw植株中AKT的表達量加而AK和AKT在調(diào)控植物應答低鉀等非生物脅迫抗性中具重要作用;另外，PEG滲透脅迫還使Ak和AkDw植株中TROK基因顯著上調(diào)表達推測轉基因植株在應答PEG介導的滲透脅迫時，一方面通過調(diào)節(jié)K富集相關基因的表達實現(xiàn)對K的吸收以提高K介導的抗旱應答脅迫能力;另一方面為了維持植物內(nèi)K含量穩(wěn)定，K外排通道隨即啟動以平衡機體內(nèi)的鉀含量。

2.5.2BRs合成相關基因表達由圖8可以看出，PEG滲透脅迫24h內(nèi)，DWF4基因在Dw和AkDw植株中的表達量始終顯著高于Ak和W植株，且在脅迫12h時Dw植株中DF4基因的表達量最高顯著高于其他煙草植株。在PEG脅迫6～12h內(nèi)，Dw和AkDw植株中的DET2基因表達量均顯著高于Ak和Wt植株，且二者間也存在顯著差異，而在PEG脅迫24h時DE72在AkDw和Dw植株中的表達差異不顯著。滲透脅迫后，CPD在轉基因煙草中表達趨勢一致，即隨著脅迫時間增加，CPD表達量逐強増，但不同轉基因植株中的增幅有一定差異，始終以在AkDw植株中的表達量最高。除Dw植株外，在PEG脅迫6～12h內(nèi)，RO73在Ak、Ak/Dw和W植株中的表達量無顯著差異，但在脅迫處理24h時，AkDw中ROT3表達量迅速上調(diào)，顯著高于Dw、Ak和Wt植株。DWF4作為BRs生物合成中的關鍵限速基因，其表達量的高低直接影向下游基因的表達。本研究中PEG滲透脅迫引起了Dw和AkDw植株中DF4在6h時即出現(xiàn)顯著表達，暗示這兩類轉基因植株可通過迅速調(diào)控BRs的合成以啟動BRs介導的抗性信號通路的表達。同時，在脅迫處理后期（24h）AkDw植株中BRs合成中下游基因DET2、CPD和RO73的高表達也表明，在應答PEG滲透脅迫時AkDw植株內(nèi)積累更多的BRS。

3討論

在植物中，K作為重要的滲調(diào)物質(zhì)和電荷載體不僅參與了細胞生長、氣孔開閉以及內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡等多種生命活動，而且在多種生物脅迫（biotic stress與非生物脅迫（abiotic stress）抗性中具有十分重要的作用。植物從外界吸收K主要依賴于K通道蛋白和K轉運體兩類系統(tǒng)3，AKT1是從Ahaliana突變體中鑒定到的一種耐低鉀（10 umol/L）及非生物脅迫的重要K通道蛋白。此外，BRs是從油菜（Bra.ssica napus）花粉中分離的一種植物類固醇激素（steroid he ormone）3，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和逆境脅迫中也具有重要作用143。DF4可編碼A.thaliana細胞色素P450（cytochrome P450），該蛋白是BRs生物合成中的關鍵限速酶，介導BRs生物合成過程中的多個22-羥基化（22 alpha-hydroxylation）步驟339。本文結果表明，無論是3～5葉期的共轉NSAKT和AIDF4的小煙苗，還是68葉期的大煙苗都表現(xiàn)出對PG滲透脅迫一定的抗性，說明NSAKT1和Atw4的共同導入能明顯增強轉基因煙草的耐旱能力。產(chǎn)生這一現(xiàn)象原因可能包括2個方面，其一是NSAKT的超量表達引起了K含量的迅速積累，同時激活了由K介導的抗非生物脅迫應答;其二是ADHF4的過表達也可能引起了轉基因煙草中BRs含量增加，故轉基因植株在應答滲透脅迫時能迅速調(diào)動BRs介導的抗逆境通路基因的表達來提高作物的耐旱能力。

PEG滲透脅迫引起了各煙草植株中H2O2不同程度的積累，但在脅迫處理3d和5d時，非轉基因煙草中H1O2含量始終顯著（p《0.05）高于轉基因植株，且在脅迫處理第5天時H2O2含量比共轉NSAKT1和ATDWF4植株高37.4%;另外，H2O2的逐漸積累引起了植株細胞脂膜不斷氧化產(chǎn)生MDA，但非轉基因植株中MDA的積累量卻顯著（p《0.05高于轉基因植株。說明轉基因植株能有效降低PEG滲透脅迫所引起的過氧化物（H2O2）及其氧化產(chǎn)物（MDA）的積累，從而減少植物細胞損害。YU等報道了轉細菌冷休克蛋白（bacterial cold shock protein）基因Secspa的小麥可通過降低MDA含量、失水率等指標提高抗旱能力;張袆等2研究超量表達NTHAKI煙草時也發(fā)現(xiàn)其應答干旱脅迫時MDA含量顯著低于非轉基因植株。AOES活性測定結果表明，在PEG脅迫前3d，轉基因煙草的SOD、POD和CAT活性始終高于非轉基因植株，但不同煙草株系抗氧化酶活性有一定差異。在PEG脅迫第5天時，除SOD外，轉基因植株中其余兩種酶活性仍顯著（p《0.05）高于非轉基因植株，這與GAO等的研究結果一致。說明轉基因植株應答PEG滲透脅迫時，能夠迅速調(diào)動機體的抗氧化酶系統(tǒng)（antioxidase system）對過量積累的O2、H2O2等進行有效的清除。同時，在轉基因植株中較低的H2O2含量證明高AOEs活性實現(xiàn)了H2O2的還原，從而起到保護植物的作用。

在PEG脅迫的單轉NSAKT1和共轉NSAKTIATDWF4植株中同時檢測到了較高的AKT1和TORK1表達，推測AKT基因的高表達可能會引起植物中K的大量積累，植物體通過調(diào)節(jié)TORK的表達增強過剩K的外排，以穩(wěn)定細胞內(nèi)正常的鉀素平衡，這一結果與譚穎等研究MHAK超量表達引起TORK基因上調(diào)的結果類似。同時，PGE滲脅迫還引起了BRs合成相關基因DWF4、DET2、CPD和ROT3的差異表達。這些基因在單轉ADWF4煙草和共轉NSAKTI和ATDWE4煙草中的高表達引起了BRs的迅速積累，從而提高植物的抗旱性。這是由于BRs一方面可通過促進可溶性蛋白和滲透調(diào)劑物的積累及水分和氣體交換提高作物對干的耐受性454，另方面可以通過與其他植物激素（如ABA和ET）或信號通路（如SApathway）互作來影響植物的抗旱性。與單轉NSAKT1和ATDWE4煙草相比，PEG滲透脅迫引起了共轉NSAKT1和ATDWF4煙草中4個BRs合成關鍵基因DWF4、DE72、ROT3和CPD顯著上調(diào)，表明共轉煙株應答滲透脅迫時引起了BRs積累。

4結論

超量共表達N.sylvestris AKT1和A.thalianeDWF4能顯著增強轉基因植株對PEG滲透脅迫的抗性，共轉NSAKTATDWF4煙株比單轉NsAK、單轉ADF4以及非轉基因植株（W）表現(xiàn)出高AOEs（SOD、POD和CAT）酶活性以及MDA和H2O2含量的降低，且可通過協(xié)同調(diào)控K吸收及BRs合成相關基因的表達實現(xiàn)轉基因植株對滲透脅迫的應答。本研究可為培育富鉀、耐旱煙草新種質(zhì)提供理想的親本材料。

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