唐健民 朱成豪 高麗梅 熊雅蘭 鄒蓉 熊忠臣 蔣運(yùn)生

摘要?[目的]優(yōu)化多穗石柯總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性的研究。[方法]運(yùn)用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合，通過超聲波輔助對其總黃酮的提取進(jìn)行優(yōu)化，利用響應(yīng)面分析法考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間對其總黃酮含量的影響，并進(jìn)行抗氧化活性分析。[結(jié)果]多穗石柯總黃酮最佳提取條件為超聲功率328.8 W、超聲頻率35 kHz、乙醇濃度60%、料液比1∶41.2（g∶mL）、提取溫度63.2℃、提取時(shí)間37.8min，總黃酮提取率為19.18%?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，當(dāng)黃酮濃度為2mg/mL時(shí)，對·OH、DPPH·和O2-·的最大清除率分別為11.70%、75.86%和32.00%，并具有很好的還原能力。[結(jié)論]通過熱溶劑浸提超聲波輔助提取法提取多穗石柯中的黃酮類化合物，所用時(shí)間短、要求溫度低、提取率好，方法簡單易行，具有明顯的優(yōu)勢。該研究采用響應(yīng)面法確定該方法的最佳提取工藝，以期為多穗石柯產(chǎn)業(yè)化及開發(fā)新天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?多穗石柯;響應(yīng)面法;總黃酮;提取工藝;優(yōu)化;抗氧化活性

中圖分類號(hào)?R?284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0181-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.055

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Lithocarpus polystachyrus Rehd by Response Surface Methodology

TANG Jian?min，ZHU Cheng?hao，GAO Li?mei et al

（Guangxi Key Laboratory of Karst Plant Conservation and Restoration Ecology， Guangxi Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guilin，Guangxi 541006）

Abstract?[Objective]To optimize the extraction process and antioxidant activity of total flavonoids from Lithocarpus polystachyrus.[Method]The combination of single factor and response surface test was used to optimize the extraction of total flavonoids by ultrasonic assist，the effects of solid?liquid ratio， extraction temperature and extraction time on the content of total flavonoids were investigated by response surface analysis， and the antioxidant activity was analyzed.[Result]The optimal extraction conditions of total flavonoids from Lithocarpus polystachyrus were ultrasonic power 328.8 W， ultrasonic frequency 35 kHz， ethanol concentration 60%， solid?liquid ratio 1∶41.2（g∶mL）， extraction temperature 63.2 ℃， extraction.At time 37.8min， the flavonoid yield was 19.18%.The results of antioxidant activity test showed that when the concentration of flavonoids was 2 mg/mL， the maximum clearance rates of ·OH， DPPH· and O2-· were 11.70%， 75.86% and 32.00%， respectively， and had good reducing ability.[Conclusion]Ultrasonic assisted extraction with hot solvent extraction is a simple and effective method for extraction of flavonoids from Lithocarpus polystachyrus.In this study， the response surface method is used to determine the optimal extraction process of this method， so as to provide theoretical basis for the industrialization and the development of new natural antioxidants.

Key words?Lithocarpus polystachyrus Rehd;Response surface method;Total flavonoids;Extraction process;Optimization;Antioxidant activity

多穗石柯（Lithocarpus polystachyrus Rehd），別名甜茶、甘茶、多穗柯或甜葉子樹，為殼斗科石柯屬常綠喬木，主要分布于我國長江以南各省區(qū)的低山密林中[1]。多穗石柯是我國傳統(tǒng)悠久的民族中藥和保健飲品，藥食同源植物之一;其味甘、性平，具有清熱解毒、化痰、安神降壓、補(bǔ)腎益陰等功效。作為民間茶飲，其茶液金黃，氣味醇香，甘甜可口，是款待賓客的至上飲品，是人類追求具有茶、糖、藥3種功能的理想飲料，具有巨大的開發(fā)前景[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多穗石柯中含有豐富的黃酮類、三萜類、多酚類等物質(zhì)，具有抗氧化、降血壓、降血糖、抗過敏等藥理作用[4-5]。鑒于對多穗石柯總黃酮類提取和抗氧化研究報(bào)道較少，該試驗(yàn)采用一種更合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法——響應(yīng)面法[6-9]，優(yōu)化超聲波提取技術(shù)對多穗石柯總黃酮提取工藝，通過響應(yīng)面法對多穗石柯總黃酮含量進(jìn)行測定，確定最佳提取工藝并利用其總黃酮進(jìn)行體外抗氧化活性，從而為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試材?多穗石柯樣品2018年10月采自于廣西植物研究所喀斯特植物園，取其完整葉片、烘干、粉碎后過60目篩備用。樣品經(jīng)廣西植物研究所蔣運(yùn)生研究員鑒定。

1.2?儀器與試劑

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;DL-720E智能超聲波;電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：MUST-12040302，中國藥品生物制品檢定所）;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰苯三酚、鄰二氮菲、PBS均為分析純試劑，桂林卓一生物有限公司。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精密稱取真空干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，乙醇溶解制成0.4 mg/mL的對照品溶液。

分別取制備好的對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL及提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中;加50%乙醇至10 mL，加5%亞硝酸鈉1 mL，混勻，靜置6 min;加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min;加4%氫氧化鈉溶液10 mL，50%乙醇調(diào)至刻度，混勻，得空白液、對照品溶液及樣品供試液;靜置15 min后在190～900 nm處進(jìn)行光譜掃描，確定選用510 nm作為測定波長。以吸光度為縱坐標(biāo)、總黃酮濃度為橫坐標(biāo)繪制回歸曲線，回歸方程為y=0.203 8x-0.007 8（R2=0.999 2），總黃酮濃度在0.001 3～0.013 0 mg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.2?供試品溶液的制備。

稱取樣品粉末0.5 g，按照料液比為1∶48.5加100%乙醇24.5 mL，61.9 ℃水浴提取20 min，超聲波頻率為35 kHz，超聲波功率為409.6 W，提取結(jié)束后過濾，洗滌液合并，定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.3.3?總黃酮提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.3.1?單因素試驗(yàn)。

（1）超聲頻率對總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品粉末，按照料液比1∶20（g∶mL）加入50%乙醇10 mL，40 ℃水浴中提取30 min，超聲功率為180 W，超聲頻率分別為高頻（61 kHz）和低頻（35 kHz），過濾，定容至50 mL，取1 mL至25 mL容量瓶中。

（2）超聲功率對總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按料液比1∶20加入50%乙醇10 mL，40 ℃水浴中提取30 min，超聲功率分別為60、180、300、420、540 W，超聲頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至50 mL，按照“1.3.1”步驟加樣，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

（3）提取溫度對總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按料液比1∶20加入50%乙醇10 mL，分別在30、50、60、70、90 ℃水浴中提取30 min，超聲功率為420 W，超聲頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至50 mL，按照“1.3.1”步驟加樣，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

（4）乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按料液比1∶20，分別加入20%、40%、60%、80%、100%乙醇10 mL，在60 ℃水浴中提取30 min，超聲功率為420 W，超聲頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至50 mL，按照“1.3.1”步驟加樣，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

（5）料液比對總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，分別按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，加入100%乙醇100 mL，在60 ℃水浴中提取30 min，超聲功率為420 W，超聲頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至50 mL，按照“1.3.1”步驟加樣，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

（6）提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按料液比1∶20，加入100%乙醇10 mL，在60 ℃水浴中分別提取10、30、60、90、120 min，超聲功率為420 W，超聲頻率為高頻（61 kHz），過濾，定容至50 mL，按照“1.3.1”步驟加樣，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

1.3.3.2?總黃酮提取率的計(jì)算方法。其計(jì)算公式為：

提取率=（C×V）/M×100%（1）

式中，C為提取液中總黃酮的含量（mg/mL）;V為提取液體積（mL），M為樣品粉末質(zhì)量（g）[10]。

1.3.3.3?響應(yīng)面分析。

采用 Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù) Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，從單因素試驗(yàn)中選取對提取結(jié)果影響比較大的4個(gè)因素（料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間）為自變量，總黃酮提取率為響應(yīng)值，共計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行組合試驗(yàn)[11-13]。因素與水平見表1。

1.3.4?體外抗氧化活性試驗(yàn)。

1.3.4.1?對·OH的清除作用。

試管中加入1 mL 0.75 mol/L鄰二氮菲、2 mL pH=7.45 PBS溶液、1 mL蒸餾水、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 0.01%H2O2，充分混勻后于37 ℃下恒溫水浴1 h。536 nm處測定其吸光度Ap;用1 mL水代替H2O2，測定其吸光度Ab;用1 mL樣液代替1 mL水，測定其吸光度As[14]。根據(jù)公式（2）計(jì)算對·OH的清除率。以VC作對照。

·OH清除率=（As-Ap）/（Ab-Ap）×100%（2）

1.3.4.2?對DPPH·的清除作用。

不同濃度的黃酮樣液與DPPH 溶液等體積混合，30min后用無水乙醇作參比，在517 nm 處測定其吸光度A1，測定不同濃度的樣液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A2;DPPH 溶液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A0，取3次平行試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)下列公式計(jì)算對DPPH·的清除率[15]。以VC作對照。

DPPH·清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%（3）

1.3.4.3?對O2-·的清除作用。取5mL 0.05 mol/L、pH=8.2 的Tris-HCL 緩沖液25℃水浴預(yù)熱20min，分別加入1mL 樣液、0.5mL 25 mmol/L 的鄰苯三酚，混勻后25℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4min，立即加入2滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)。299 nm處測定吸光度A1，空白對照組的吸光度A0。將鄰苯三酚溶液用0.5 mL 蒸餾水代替，得到吸光度A2。取3 次平行試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)下列公式計(jì)算對O2-·的清除率。以VC作對照[16]。

O2-·清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%（4）

1.3.4.4?總還原力的測定。

1.0mL 樣液加入2.5mL 的1%鐵氰化鉀溶液和2.5mL 的0.22 mol/L 磷酸鹽緩沖液，混合均勻后于50℃水浴中反應(yīng)30min，迅速冷卻加入10%三氯乙酸2.5mL，在4 000 r/min下離心10min。最后取2.5mL上清液，加2.5mL 蒸餾水和2.5mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10min 測定700 nm 處的吸光度[17]。以VC作對照。

2?結(jié)果與分析

2.1?單因素試驗(yàn)

2.1.1?提取溫度的選擇。

由圖1可見，隨著溫度的升高總黃酮的提取率先增加后降低，在60 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)峰值（13.3%）。繼續(xù)升高溫度，總黃酮提取率逐漸降低，高溫條件下，致使黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)被破壞或影響其析出，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。按照單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇，應(yīng)以60 ℃為宜。

2.1.2?乙醇濃度的選擇。

由圖2可知，在乙醇單因素條件下，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮的提取率先升高后降低。在乙醇濃度為60%的條件下，所提取總黃酮提取率達(dá)到最高值（13.58%）。隨著濃度增加，致使脂溶性雜質(zhì)增加，抑制了總黃酮的浸出，逐漸降低了其提取率，因此選擇60%的乙醇濃度作為提取溶劑。

2.1.3?料液比的確定。由圖3可知，隨著料液比的增多，總黃酮的提取率先增加后降低。在料液比1∶50處，所提取的總黃酮提取率達(dá)18.62%。繼續(xù)增大料液比后，總黃酮提取率不再增加甚至明顯降低，且繼續(xù)增大溶劑量既浪費(fèi)溶劑又不易回收，所以選擇料液比1∶50為宜。

2.1.4?超聲功率的選擇。

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，總黃酮的提取率也相應(yīng)增加。在超聲功率達(dá)300 W時(shí)，所提取的總黃酮提取率為13.86%。繼續(xù)增大超聲功率，總黃酮提取率開始降低?？赡苡捎诔暪β实脑龃髮?dǎo)致了總黃酮的結(jié)構(gòu)被破壞，所以超聲功率以300 W為宜。

2.1.5?提取時(shí)間的確定。

由圖5可知，在10～30min內(nèi)總黃酮提取率隨著時(shí)間的增加而增大，在30 min總黃酮提取率達(dá)到最高值（12.78%）。隨著時(shí)間繼續(xù)增加總黃酮提取率開始降低，可能是因?yàn)殚L時(shí)間使黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞或粉末溶出其他雜質(zhì)，使得總黃酮提取率降低。故為了保證總黃酮的提取率以及減小提取周期，以30 min為宜。

2.1.6?超聲頻率的選擇。經(jīng)分析，當(dāng)超聲頻率為低頻（35 kHz）時(shí)，總黃酮的提取率要優(yōu)于高頻（61 kHz），達(dá)12.85%。所以在超聲輔助提取時(shí)選用低頻（35 kHz）即可。

2.2?響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1?響應(yīng)面正交試驗(yàn)。根據(jù)表1設(shè)定的水平和因素，共設(shè)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24 個(gè)為析因點(diǎn)，5 個(gè)為零點(diǎn)。得到各個(gè)試驗(yàn)條件的總黃酮提取率，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由Orign 2015軟件分析得到回歸方程為：Y=19.13+0.033A+0.069B+0.17C+0.11D-0.015AB+0.06AC-0.038AD- 0.04BC+0.028BD-0.04CD-0.16A2-0.13B2-0.24C2-0.19D2，其中Y為總黃酮含量的預(yù)測值。該模型的預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.984 7，矯正系數(shù)Adj R2=0.969 4，說明試驗(yàn)的實(shí)際值和預(yù)測值擬合度較好。模型P<0.000 1，說明該模型極其顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。A、C 2個(gè)因素所模擬的一次項(xiàng)小于0.05，說明因變量和所選自變量之間的線性關(guān)系顯著，該回歸方程能代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果。模擬的二次項(xiàng)B2（P<0.01），表明B因素對總黃酮提取率達(dá)到極顯著的水平，交互項(xiàng)BC的P 值<0.05，達(dá)到顯著水平，由此可知，料液比與超聲功率、超聲功率與提取時(shí)間、提取溫度與提取時(shí)間這些因素之間都存在一定的交互作用，并且它們之間的交互作用會(huì)對總黃酮提取率產(chǎn)生顯著的影響。

2.2.2?響應(yīng)面交互作用分析。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件，將AC、BD、CD交互進(jìn)行分析比較，做出響應(yīng)面曲線圖，見圖6。由圖6可知，當(dāng)各因素在一定范圍內(nèi)增大時(shí)，對應(yīng)的響應(yīng)值也增大;但當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，各因素的值繼續(xù)增大時(shí)，其響應(yīng)值卻不斷減小。等高線圖的中心點(diǎn)在3D 圖上的投影即最高點(diǎn)，表明該點(diǎn)的提取率最高。

2.2.3?優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)。

依據(jù)以上響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒Y(jié)果分析，得出最佳提取條件下總黃酮提取率為19.18%，料液比1∶41.2，超聲功率328.8 W，提取溫度63.2℃，提取時(shí)間37.8min。在此最佳條件下，將平行驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，可得總黃酮提取率平均為19.07%。實(shí)際所測得的提取率的平均值和預(yù)測值減少0.11%，表明該模型的可靠性較高，并且提取工藝的重復(fù)性良好，在后續(xù)試驗(yàn)中可選取以上條件進(jìn)行抗氧化活性研究。

2.3?總黃酮體外抗氧化活性?根據(jù)圖7能夠看出，總黃酮對·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，并且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對自由基的清除能力呈現(xiàn)量效關(guān)系。當(dāng)黃酮濃度為2 mg/mL左右時(shí)，對·OH、O2-·和DPPH·的最大清除率分別為11.70%、32.00%和75.86%。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，總黃酮和VC的還原力均隨濃度的增大而增大（圖8），線性關(guān)系較好，其中2 mg/mL的黃酮與0.67 mg/mL的VC幾乎均等，可見其總黃酮體外抗氧化活性較好。

3?結(jié)論

該試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化多穗石柯總黃酮的提取工藝條件，然后在最佳提取條件下對其進(jìn)行含量測定，并研究其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，多穗石柯總黃酮提取的最優(yōu)條件為：超聲功率328.8 W、超聲頻率35 kHz、乙醇濃度60%、料液比1∶41.2、提取溫度63.2 ℃、提取時(shí)間37.8 min，總黃酮提取率為19.18%;其黃酮對·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，當(dāng)總黃酮濃度為2 mg/mL時(shí)，對它們的最大清除率分別為11.70%、32.00%和75.86%。濃度為2 mg/mL的總黃酮與0.67 mg/mL VC的吸光度幾乎均等，可見其總黃酮體外抗氧化活性較好。通過響應(yīng)面法優(yōu)化，采用超聲波提取提取法多穗石柯中的黃酮類化合物，所用時(shí)間短，要求溫度低，提取率好，方法簡單易行，具有明顯的優(yōu)勢。

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