李 浪，張澤俊，張正彪，范賢林

（昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000）

1 前言

魔芋（Konjac，為天南星科魔芋屬多年生宿根性草本耐陰植物的地下塊蓮，學(xué)名為藤龍，又名鬼芋、花桿蓮、天南星等，中藥稱蛇六谷）[1]。有學(xué)名的魔芋屬種已有170 多種，塊莖呈扁圓型、葉柄呈圓柱形、掌狀復(fù)葉呈淡綠色多帶有暗紫色斑點(diǎn)，株高40 至70 公分，生長(zhǎng)于疏林下，開(kāi)紫紅色花，最早發(fā)現(xiàn)于斯里蘭卡和印度。我國(guó)早在一千多年前就已經(jīng)開(kāi)始種植，在晉朝的《蜀都賦》中就有詳細(xì)記載[2]?，F(xiàn)主要生長(zhǎng)在我國(guó)湖北、云南、四川等地，是我國(guó)的一種古典醫(yī)藥[3]。魔芋是一種藥食兩用的多年生草本植物，果實(shí)中含大量的葡甘聚糖及豐富的生物堿、黃酮、淀粉、神經(jīng)酰胺、纖維素和礦物質(zhì)等多種功能性成分，均具有明顯的生物活性。魔芋果實(shí)具有多種特性其中包括高纖維、低蛋白、低脂肪、膨脹率高等，其藥用功效方面還具有降三高、抗氧化、保健美容、抗癌解毒等多種療效[4-6]，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

魔芋中的蛋白質(zhì)是人體極為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是生物體細(xì)胞組織構(gòu)成的重要成分之一。蛋白質(zhì)與人體的營(yíng)養(yǎng)代謝、氧氣運(yùn)輸、信息交流、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)免疫和遺傳物質(zhì)等相關(guān)[7]，具有構(gòu)成機(jī)體、修復(fù)組織、構(gòu)成酶和激素等活性物質(zhì)、供給機(jī)體能量等生理功能，也是人體中氮的唯一來(lái)源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[8]。目前而言，國(guó)內(nèi)對(duì)昭通魔芋中各種有效成分提取分離所得的產(chǎn)品純度還不高，使得魔芋的利用率不高造成資源浪費(fèi)，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正意義上的綜合利用。測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有經(jīng)典的方法和先進(jìn)的方法，其中經(jīng)典的方法包括雙縮脲試劑法、Folin-酚試劑法、紫外吸收測(cè)定法、考馬斯亮藍(lán)法等；先進(jìn)的方法包括近紅外光譜(Near Infrared Espectroscopy，簡(jiǎn)稱NIR)分析技術(shù)、膠體金染色法、杜馬斯燃燒法、流動(dòng)注射分析法等[9]。雙縮脲試劑法本身具有試劑單一、干擾物質(zhì)較少、呈色性好、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[10]，但靈敏度低需要把樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1～10 mg/mL，這時(shí)測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，所以本實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲試劑法作為首選測(cè)定方法[11,12]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)昭通市5 個(gè)不同地區(qū)花魔芋中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的研究，為魔芋產(chǎn)品的附加值提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的花魔芋采自昭陽(yáng)區(qū)、彝良縣、大關(guān)縣、鎮(zhèn)雄縣、永善縣5 個(gè)地區(qū)。將花魔芋洗凈后切片，置于40℃烘箱烘干，烘干后的魔芋經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后置于60 目，制得魔芋干粉，并于清潔干燥處放置，備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備與主要試劑

2.2.1 儀器設(shè)備

DFT-250A 手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、EP64C 專業(yè)型分析天平（0.0001 g）（美國(guó)奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）、HH-S24 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）、721 型可見(jiàn)分光光度計(jì)（山東高密彩虹分析儀器有限公司）、800 型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）、DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司）。

2.2.2 試劑

四氯化碳（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、酒石酸甲鈉（成都化學(xué)試劑廠）、硫酸銅（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、碘化鉀（廣東光華化學(xué)廠有限公司）、氫氧化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、牛血清蛋白（美侖生物化學(xué)試劑科技有限公司）以上藥品均是分析純。

雙縮脲試劑A 液配制：將0.1250 mol 氫氧化鈉放入100 mL 燒杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容，得0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液。B 液配制：將0.004 mol 硫酸銅（1 g）、0.0040 mol 碘化鉀和2.5000 g 酒石酸甲鈉依次加入100 mL 燒杯中溶解后移入250 mL 容量瓶中定容，得0.0160 mol/L 硫酸銅溶液。

0.0500 mol/L 氫氧化鈉溶液：將0.0500 g 氫氧化鈉放入100 mL 燒杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容備用。

5 mg/mL 的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取0.2500 g牛血清蛋白于燒杯中用0.0500 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解，移入50 mL 容量瓶中用0.0500 mol/L 的氫氧化鈉溶液定容備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

在比較紫外吸收測(cè)定法、雙縮脲試劑法、考馬斯亮藍(lán)法、Folin-酚試劑法四種方法測(cè)得蛋白質(zhì)含量之間差異均不顯著[12]。蛋白質(zhì)中均含有碳、氫、氧、氮四種元素，其中含量最恒定的為氮元素，占16%左右[13]，蛋白質(zhì)含有2 個(gè)以上肽鍵。在強(qiáng)堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，與硫酸銅形成紫色絡(luò)合物，該絡(luò)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，所以根據(jù)氮元素的含量進(jìn)行推算魔芋中蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲試劑法能夠有效地消除脂肪、糖類等物質(zhì)的干擾，其精密度與準(zhǔn)確度較高，有利于提高實(shí)驗(yàn)效率，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用[14]。雙縮脲法測(cè)定速度較快(約60 min)、對(duì)蛋白質(zhì)呈色定性好、干擾物少、操作簡(jiǎn)便、不必提純蛋白質(zhì)，但靈敏度低需要把樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1～10 mg/mL，這時(shí)測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。雙縮脲試劑法利用721 型分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，可直接測(cè)定蛋白質(zhì)含量[15,16]因此作為本實(shí)驗(yàn)方法。

2.3.1 最大吸收波長(zhǎng)

在10 mL 容量瓶中加入2 mL 含量為5 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，再加入0.5 mL 蒸餾水，用7.5 mL 雙縮脲試劑定容，搖勻靜置5min。然后于721型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)370 至580 nm 下，每間隔10 nm 測(cè)定吸光度確定最大吸收波長(zhǎng)范圍，再以每間隔2 nm 測(cè)定吸光度確定最大吸收波長(zhǎng)。以0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液2.5 mL 蒸餾水7.5 mL 雙縮脲試劑定容為空白試劑對(duì)照比色，多次實(shí)驗(yàn)選用最佳數(shù)據(jù)確定最大吸收波長(zhǎng)。

2.3.2 單因素試驗(yàn)

為了確定魔芋蛋白質(zhì)最佳測(cè)定工藝條件，研究了四氯化碳的量和測(cè)定溫度對(duì)魔芋蛋白質(zhì)的影響作用。

2.3.2.1 四氯化碳量的影響

用制得的魔芋干粉樣品準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)入5 個(gè)標(biāo)記好的25 mL 容量瓶中，分別準(zhǔn)確加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 四氯化碳，24.5、24、23.5、23.0、22.5 mL 雙縮脲試劑定容。分別劇烈震蕩10min 靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液。分別取4 mL清液于10 mL 容量瓶中用雙縮脲試劑定容，以空白試劑對(duì)照比色，多次實(shí)驗(yàn)選用最佳數(shù)據(jù)確定加入四氯化碳的量。

2.3.2.2 溫度的影響

用制得的魔芋干粉樣品準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg 蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)入錐形瓶，加入0.5 mL 四氯化碳24.5 mL 雙縮脲試劑后放入數(shù)顯恒溫水浴鍋中（從20℃至60℃每次升高5℃）劇烈震蕩10min，靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液。分別取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中用雙縮脲試劑定容，以空白試劑對(duì)照比色，做多次實(shí)驗(yàn)選用最佳數(shù)據(jù)確定實(shí)驗(yàn)溫度。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

以牛血清蛋白制得的含量為5 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用6 個(gè)10mL 的容量瓶做好標(biāo)記分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，再分別加入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL 蒸餾水，最后用7.5 mL 雙縮脲試劑定容，搖勻靜置5min 用721 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm下以0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液容量瓶為空白對(duì)照比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.4 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定

用制得的魔芋干粉樣品準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于25 mg蛋白質(zhì)樣品，分別轉(zhuǎn)入5 個(gè)標(biāo)記好的25 mL 容量瓶中，加入上述最佳四氯化碳量，用雙縮脲試劑定容。分別劇烈震蕩10min 靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液，分別吸取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度值，做三次平行實(shí)驗(yàn)計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 最大吸收波長(zhǎng)結(jié)果

按2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)370 nm 至580 nm 下測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明波長(zhǎng)540 nm 至560 nm 有最佳測(cè)定波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，由圖1已知在550 nm 處為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 最大吸收波長(zhǎng)結(jié)果Tab.1 Maximum absorption wavelength results

圖1 最大吸收波長(zhǎng)結(jié)果Fig.1 Maximum absorption wavelength result

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立

按2.3.3 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm 下測(cè)定吸光度，結(jié)果如表2圖2所示，以吸光度為橫坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：Y=8.29X +0.036，其中牛血清蛋白濃度(X)和吸光度(Y)的相關(guān)系數(shù)R2=0.9998 方程的線性良好可應(yīng)用。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果Tab.2 Standard curve production results

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果Fig.2 Standard curve production results

3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 四氯化碳量的影響

按2.3.2.1 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550 nm 下測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，由表已知四氯化碳最佳使用量1.5 mL。

表3 四氯化碳的量結(jié)果Tab.3 Results of the amount of carbon tetrachloride

3.3.2 溫度的影響

按2.3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在550 nm 波長(zhǎng)、1.5 mL 四氯化碳條件下測(cè)定吸光度。如表4所示實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)蛋白質(zhì)失去活性無(wú)法測(cè)定，溫度在20 ℃至50 ℃范圍雙縮脲法對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色反應(yīng)影響較小可忽略不計(jì)[17]。

表4 溫度的影響結(jié)果Tab.4 The effect of temperature

3.4 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

按2.3.4 實(shí)驗(yàn)方法用721 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為550 nm、室溫、1.5 mL 四氯化碳條件下測(cè)定，結(jié)果顯示：如表5所示不同地區(qū)魔芋中蛋白質(zhì)的含量不同，昭陽(yáng)區(qū)（2.04%）＞彝良縣（2.02%）＞大關(guān)縣（1.98%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.72%）＞永善縣（1.27%）。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.5 Sample measurement results

3.5 測(cè)定方法的檢驗(yàn)

按標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=8.29X + 0.036 回歸方程計(jì)算所有的結(jié)果。

3.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液(5 mg/mL)0.5 mL 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6 次測(cè)定其吸光度，如表6所示得RSD=4.6%，結(jié)果小于5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精密度好。

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Precision experiment results

3.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液1 mL，每隔10 min 測(cè)定1 次，比較穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示得RSD=1.2%，由表已知在顯色60 min時(shí)間內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Stability experiment results

3.5.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一原料樣品，多次配制每次取1 mL 樣品液按樣品測(cè)定方法，分別測(cè)定其吸光度，檢驗(yàn)該測(cè)定方法的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示得RSD=3.60%，結(jié)果小于5%，表明重復(fù)性較好。

表8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Reproducibility experiment results

3.5.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取已配制的1 mg/mL 樣品溶液1 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述樣品測(cè)定方法分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示樣品平均回收率均為114.96%，RSD 為4.95%，表明本法可行[18]。

表9 回收率實(shí)驗(yàn)Tab.9 Recovery rate experiment

4 結(jié)論

本研究選用昭通市花魔芋資源作為研究對(duì)象，對(duì)5 個(gè)不同地方花魔芋的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行研究比較，用雙縮脲試劑法對(duì)不同地區(qū)魔芋中蛋白質(zhì)進(jìn)行含量的測(cè)定，結(jié)果顯示：不同地區(qū)魔芋中蛋白質(zhì)的含量不同且昭陽(yáng)區(qū)（2.04%）＞彝良縣（2.02%）＞大關(guān)縣（1.98%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.72%）＞永善縣（1.27%）。由實(shí)驗(yàn)已知雙縮脲法在波長(zhǎng)為550 nm下測(cè)定魔芋蛋白質(zhì)時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1～10 mg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，變異系數(shù)小，重復(fù)性好，平均回收率和精密度都很高。該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，為快速測(cè)定植物中蛋白質(zhì)成分含量提供了重要參考[19]雙縮脲試劑法測(cè)定魔芋蛋白質(zhì)含量所需時(shí)間少，操作簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，是一種非常有前途的測(cè)定蛋白質(zhì)的方法[20]。魔芋中蛋白質(zhì)是人體極為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是生物體細(xì)胞組織構(gòu)成的重要成分之一。蛋白質(zhì)含量的多少也是反映食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和用途的重要指標(biāo)，同時(shí)也決定著食品的商業(yè)價(jià)值，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)含量的快速準(zhǔn)確測(cè)定不僅是滿足人們的營(yíng)養(yǎng)需求，而且在一定程度上保障了消費(fèi)者的合法權(quán)益。但目前由于技術(shù)水平的限制，蛋白質(zhì)檢測(cè)儀方法還需要進(jìn)一步改進(jìn)。探索藥品儀器測(cè)定不同種類蛋白質(zhì)的原理，實(shí)現(xiàn)高速、精確的技術(shù)檢測(cè)體系，以滿足人們對(duì)各種蛋白質(zhì)的測(cè)定。