牛四坤

(山西藥科職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系，山西 太原 030031)

黃連(Coptischinensis)，又稱(chēng)味連、雞爪連，屬毛茛科黃連屬多年生草本植物，其清熱燥濕、瀉火解毒功效顯著[1]。黃連是典型的忌連作藥用植物，連作常導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育不良、病蟲(chóng)害頻發(fā)，產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降，嚴(yán)重制約黃連的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[2-3]。為減少黃連病害，藥農(nóng)在生產(chǎn)中往往使用大量的化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，不僅造成黃連藥材安全隱患，而且對(duì)土壤環(huán)境造成一定的污染[4]。近年來(lái)，人們對(duì)中藥材品質(zhì)提出越來(lái)越高的要求，采用無(wú)公害手段緩解黃連連作障礙已成為當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一[5]。

植物連作障礙的作用機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括化感自毒作用、土壤生態(tài)環(huán)境災(zāi)變等[6-7]。大量研究表明，由植物根際自毒物質(zhì)介導(dǎo)的微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成連作障礙發(fā)生的主要因素，合理調(diào)控土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)是緩解連作障礙的關(guān)鍵所在[8-10]。近年來(lái)，利用生物間相生相克的原理合理安排作物間、輪、套作制度，已成為無(wú)公害緩解連作障礙的研究熱點(diǎn)之一[11]。相關(guān)研究表明，大蔥間作桔梗可提高土壤細(xì)菌數(shù)量并降低真菌數(shù)量，緩解桔梗連作障礙[12]；生菜與菠菜輪作可提高土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度，改善群落結(jié)構(gòu)，緩解生菜連作障礙[13]；小麥與蠶豆間作可改善蠶豆根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，提高多樣性和豐富度，降低鐮刀菌數(shù)量，緩解蠶豆連作障礙[14]。

伴生栽培是一種新型的栽培方式，不以收獲伴生植物為目的，主要是利用伴生植物的相生相克作用達(dá)到緩解連作障礙的效果[15]。伴生栽培與間、輪、套作的最大區(qū)別是不以收獲伴生植物為目的，從而減少了伴生作物對(duì)土壤水分、養(yǎng)分的爭(zhēng)奪，最大程度保障主栽作物的收益。楊瑞娟等[16]研究表明，大麥伴生栽培可提高番茄根區(qū)的土壤酶活性，改善微生物群落結(jié)構(gòu)，降低根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)生率。徐偉慧[17]研究表明，小麥伴生可顯著提高連作條件下西瓜根際土壤微生物多樣性，改善群落結(jié)構(gòu)，提高連作西瓜產(chǎn)量，降低枯萎病發(fā)病率。目前，中藥材連作障礙的緩解仍以化學(xué)手段為主，無(wú)公害緩解手段較為缺乏。伴生植物對(duì)中藥材植物連作障礙的緩解效果以及根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，以黃連為試驗(yàn)材料，研究了小麥、大蔥及黑麥草伴生栽培對(duì)連作黃連產(chǎn)量及發(fā)病率的影響，篩選出最佳的黃連伴生植物，并從根際微生物區(qū)系變化方面對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初探，以期為黃連連作障礙的無(wú)公害緩解提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤取自山西省運(yùn)城市黃連種植基地，非黃連連作土壤基本理化性質(zhì)為pH值7.15，EC值6.11，有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為46.52 g/kg、61.12 mg/kg、30.52 mg/kg、53.56 mg/kg；連作3 a土壤基本理化性質(zhì)為pH值6.25，EC值6.83，有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為52.65 g/kg、52.65 mg/kg、26.82 mg/kg、50.06 mg/kg。供試黃連品種為黃連1號(hào)，購(gòu)自安康市振興集團(tuán)生物科技有限公司。供試3種伴生作物中，小麥品種為品資Ⅱ-5，由黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；大蔥品種為章丘大蔥，購(gòu)自菏澤市三系大蔥良種有限公司；黑麥草品種為杰威，購(gòu)自四川金種燎原種業(yè)科技有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年4月10日開(kāi)始實(shí)施，采用小區(qū)完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)5個(gè)處理，分別為頭茬黃連(CK1)、連作3 a黃連(CK2)、連作3 a黃連與小麥伴生栽培(T1)、連作3 a黃連與大蔥伴生栽培(T2)和連作3 a黃連與黑麥草伴生栽培(T3)。小區(qū)面積30 m2，平畦栽培，選取長(zhǎng)勢(shì)、大小一致的黃連幼苗進(jìn)行定植，株行距為10 cm×15 cm，每個(gè)處理3次重復(fù)。黃連幼苗定植后1周，于距離黃連幼苗植株6 cm處分別點(diǎn)播小麥、大蔥和黑麥草種子進(jìn)行伴生處理。伴生植物株高長(zhǎng)到30 cm左右時(shí)，人工留茬至10 cm左右，留茬的生長(zhǎng)點(diǎn)繼續(xù)生長(zhǎng)。整個(gè)試驗(yàn)期間，各處理由專(zhuān)人進(jìn)行統(tǒng)一的水肥管理，同時(shí)杜絕使用殺菌劑。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 產(chǎn)量 試驗(yàn)結(jié)束后收獲時(shí)測(cè)定各處理的黃連產(chǎn)量，并進(jìn)行換算。

1.3.2 發(fā)病率 調(diào)查整個(gè)試驗(yàn)期間黃連的發(fā)病株數(shù)并計(jì)算發(fā)病率，發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/定植株數(shù)×100%。

1.3.3 土壤微生物數(shù)量、多樣性及群落結(jié)構(gòu)

1.3.3.1 土壤取樣方法 于黃連發(fā)病盛期，用5點(diǎn)采樣法采集各處理的根際土壤，并保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于土壤微生物數(shù)量、多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3.3.2 微生物數(shù)量測(cè)定 土壤細(xì)菌、真菌及放線(xiàn)菌數(shù)量測(cè)定采用稀釋平板法，培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基和改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基。

1.3.3.3 土壤微生物總DNA提取 采用 Fast DNA?SPIN Kit for Soil土壤總基因組提取試劑盒提取，用NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量與濃度，采用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。

1.3.3.4 土壤細(xì)菌高通量測(cè)序 以土壤總DNA為模板，以Miseq測(cè)序平臺(tái)通用引物F341-R806對(duì)V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 U/μLTaq酶0.25 μL，DNA模板2 μL，正反向引物各0.5 μL，滅菌超純水12.75 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，并根據(jù)回收DNA濃度，按照1∶1的比例等量進(jìn)行混合，交送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3.5 土壤真菌高通量測(cè)序 以土壤總DNA為模板，以通用引物ITS1(5′-TCCGTTGGTGAACCAGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-

C-3′)對(duì)真菌ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系與細(xì)菌反應(yīng)體系一致。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物回收參照細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收方法，回收產(chǎn)物按1∶1等量混合并進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用QIIME軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜和優(yōu)化，利用UPARES軟件對(duì)相似度在97%水平以上的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，并基于細(xì)菌的Silva數(shù)據(jù)庫(kù)和真菌的Unite數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)各樣本在不同分類(lèi)學(xué)水平上的群落組成。利用MOTHUR軟件進(jìn)行土壤微生物α多樣性分析，包括Chao1豐富度指數(shù)、Ace豐富度指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)。采用Excel 2007和SPSS 18.0分別進(jìn)行數(shù)據(jù)整理作圖和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同作物伴生對(duì)連作黃連產(chǎn)量及發(fā)病率的影響

由圖1可以看出，連作顯著降低黃連產(chǎn)量、提高黃連發(fā)病率，而伴生栽培則可不同程度地緩解黃連連作障礙。與頭茬黃連(CK1)相比，連作3 a的黃連(CK2)產(chǎn)量降低43.29%，發(fā)病率提高59.92個(gè)百分點(diǎn)。伴生栽培可顯著提高連作黃連產(chǎn)量、降低黃連發(fā)病率。其中，T1、T2和T3處理黃連產(chǎn)量分別較CK2顯著提高53.31%、67.63%、42.92%，發(fā)病率分別較CK2顯著降低39.13、47.32、32.50個(gè)百分點(diǎn)。說(shuō)明伴生栽培可顯著緩解黃連的連作障礙，其中，以大蔥伴生栽培緩解黃連連作障礙效果最佳。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同作物伴生對(duì)連作黃連根際微生物數(shù)量的影響

由表1可以看出，連作顯著降低黃連根際土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌含量，顯著提高真菌含量，最終使微生物總量顯著降低。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤微生物總量降低4.14%，其中，細(xì)菌和放線(xiàn)菌含量分別降低18.20%和21.20%，真菌含量提高60.37%，細(xì)菌/真菌和放線(xiàn)菌/真菌顯著降低，土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化。

伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤的細(xì)菌、放線(xiàn)菌含量，顯著降低真菌含量。T1、T3處理微生物總量較CK2分別提高1.95%、0.49%，其中，細(xì)菌含量分別提高14.06%、9.08%，放線(xiàn)菌含量分別提高11.49%、5.52%，真菌含量分別降低21.67%、14.83%，細(xì)菌/真菌分別提高45.61%、28.07%，放線(xiàn)菌/真菌分別提高42.34%、23.89%。T2處理微生物總量雖然較CK2降低1.89%，但主要表現(xiàn)為真菌含量下降(30.61%)，細(xì)菌和放線(xiàn)菌含量則分別提高12.15%和10.80%。說(shuō)明伴生栽培可顯著提高連作黃連根際土壤的細(xì)菌和放線(xiàn)菌含量，降低真菌含量，促進(jìn)連作土壤由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)化，其中，以大蔥伴生栽培細(xì)菌/真菌和放線(xiàn)菌/真菌比值最高。

表1 不同作物伴生栽培對(duì)連作黃連根際微生物數(shù)量的影響Tab.1 Effects of companion planting with different crops on microorganisms quantity in rhizosphere soil of continuous cropping Coptis chinensis

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.3 不同作物伴生對(duì)連作黃連根際微生物多樣性的影響

由表2可知，各處理的細(xì)菌、真菌覆蓋率均大于98%，說(shuō)明本研究獲得的微生物序列覆蓋度較好，可用于細(xì)菌、真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析。Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是衡量微生物多樣性和豐富度的重要參數(shù)，其中，Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)越大表示樣本多樣性和豐富度越高，Simpson指數(shù)越高代表多樣性越低。連作顯著降低黃連根際土壤細(xì)菌和真菌的多樣性和豐富度。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)分別顯著降低11.65%、11.61%、21.63%，而Simpson指數(shù)提高30.77%；根際土壤真菌Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)分別顯著降低41.13%、41.00%、32.46%，Simpson指數(shù)提高83.33%。

伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤的細(xì)菌、真菌多樣性。與CK2相比，T1、T2、T3處理細(xì)菌Chao1指數(shù)分別提高7.84%、11.03%、4.57%，Ace指數(shù)分別提高7.53%、10.76%、4.35%，Shannon指數(shù)分別提高15.07%、21.53%、10.57%，Simpson指數(shù)分別降低13.24%、17.65%、7.35%；真菌Chao1指數(shù)分別提高40.81%、54.08%、30.32%，Ace指數(shù)分別提高40.39%、52.81%、29.73%，Shannon指數(shù)分別提高28.64%、36.41%、15.53%，Simpson指數(shù)分別降低27.27%、15.15%、36.36%。說(shuō)明伴生栽培可顯著提高連作黃連根際土壤細(xì)菌和真菌的多樣性與豐富度，其中，以大蔥伴生栽培多樣性和豐富度最高。

表2 不同作物伴生栽培對(duì)連作黃連根際微生物多樣性的影響Tab.2 Effects of companion planting with different crops on microorganisms diversity in rhizosphere soil of

注：同列不同小寫(xiě)字母表示同一微生物種類(lèi)不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level among different treatments of the same microbial species.

2.4 不同作物伴生對(duì)連作黃連根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 如圖2A所示，5種種植模式下，土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門(mén)水平上相同，主要包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、消化螺旋桿菌門(mén)(Nitrospirae)和綠藻門(mén)(Cyanobacteria)，約占細(xì)菌總豐度的92.83%～96.08%。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、疣微菌門(mén)和消化螺旋桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低，而厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠灣菌門(mén)相對(duì)豐度顯著上升(P<0.05)。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、疣微菌門(mén)和消化螺旋桿菌門(mén)相對(duì)豐度，顯著降低厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠灣菌門(mén)相對(duì)豐度(P<0.05)，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、疣微菌門(mén)、消化螺旋桿菌門(mén)相對(duì)豐度分別提高20.43%、54.68%、62.30%、100.00%，厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、綠灣菌門(mén)相對(duì)豐度分別降低33.81%、21.66%、20.11%、58.54%。

如圖2B所示，土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬在黃連5種種植模式根際土壤中表現(xiàn)一致，約占細(xì)菌總豐度的51.88%～53.37%，但是相對(duì)豐度存在較大差異。與CK1相比，連作3 a的黃連根際土壤紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、韋榮球菌屬(Veillonella)和乳球菌屬(Lactococcus)相對(duì)豐度均顯著降低，而檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)、普氏菌屬(Prevotella)、消化螺菌屬(Nitrospira)和假單胞菌屬(Pseudomonas)則顯著升高(P<0.05)。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤紅游動(dòng)菌屬、韋榮球菌屬和乳球菌屬相對(duì)豐度，顯著降低檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、消化螺菌屬和假單胞菌屬相對(duì)豐度(P<0.05)，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，紅游動(dòng)菌屬、韋榮球菌屬、乳球菌屬相對(duì)豐度分別提高28.03%、35.34%、91.75%，檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、消化螺菌屬、假單胞菌屬相對(duì)豐度分別降低17.48%、40.68%、45.27%、60.78%、63.16%。

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu) 如圖2C所示，5種種植模式下，土壤優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)主要包括子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、球囊菌門(mén)(Glomeromycota)和纖毛亞門(mén)(Ciliophora)，約占真菌總豐度的81.43%～96.82%。連作顯著降低了黃連根際土壤子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、壺菌門(mén)和球囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，提高了接合菌門(mén)和纖毛亞門(mén)的相對(duì)豐度。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、壺菌門(mén)和球囊菌門(mén)的相對(duì)豐度，顯著降低接合菌門(mén)和纖毛亞門(mén)的相對(duì)豐度，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、壺菌門(mén)、球囊菌門(mén)相對(duì)豐度分別提高26.62%、39.20%、50.00%、117.11%，接合菌門(mén)和纖毛亞門(mén)相對(duì)豐度分別降低49.25%和22.13%。

A.細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度；B.細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度；C.真菌門(mén)水平相對(duì)豐度；D.真菌屬水平相對(duì)豐度

如圖2D所示，黃連5種種植模式具有相同的優(yōu)勢(shì)真菌屬，約占真菌總豐度的48.60%～59.52%，不同種植模式間相對(duì)豐度存在較大差異。連作顯著降低了黃連根際土壤支頂孢屬(Acremonium)、綠僵菌屬(Metarhizium)、柄孢殼屬(Zopfiella)和鏈孢菌屬(Alternaria)的相對(duì)豐度，提高了假霉樣真菌屬(Pseudallescheria)、被孢霉屬(Mortierella)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和絲孢菌屬(Scedosporium)的相對(duì)豐度。與CK2相比，伴生栽培可顯著提高連作條件下黃連根際土壤支頂孢屬、綠僵菌屬、柄孢殼屬和鏈孢菌屬的相對(duì)豐度，顯著降低假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬和絲孢菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05)，其中，以大蔥伴生(T2)提高(或降低)幅度最大，支頂孢屬、綠僵菌屬、柄孢殼屬、鏈孢菌屬相對(duì)豐度分別提高86.58%、36.19%、851.61%、54.55%，假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬、絲孢菌屬相對(duì)豐度分別降低32.62%、30.03%、44.95%、24.12%、42.11%。

2.5 土壤微生物菌群豐度與黃連發(fā)病率的相關(guān)性分析

由表3可知，與黃連發(fā)病率呈正相關(guān)的菌屬有12類(lèi)，相關(guān)性由強(qiáng)到弱依次為假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、青霉屬、普氏菌屬、絲孢菌屬、消化螺菌屬、假單胞菌屬、浮霉菌屬和生絲微菌屬；與黃連發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)的菌屬有7類(lèi)，相關(guān)性由強(qiáng)到弱依次為紅游動(dòng)菌屬、韋榮球菌屬、支頂孢屬、柄孢殼屬、乳球菌屬、綠僵菌屬和鏈孢菌屬。

表3 土壤微生物菌群豐度與黃連發(fā)病率的相關(guān)性Tab.3 Correlation between abundance of soil microbial community and disease incidence of Coptis chinensis

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在 0.01 水平上顯著相關(guān)。

Note:* indicates a significant correlation at 0.05 level; ** indicates a significant correlation at 0.01 level.

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，連作會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，顯著降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高作物發(fā)病率，而合理的栽培制度(如連作、輪作、套作等)可起到一定的緩解作用[3,7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，連作3 a的黃連產(chǎn)量較頭茬黃連降低43.29%，發(fā)病率提高59.92個(gè)百分點(diǎn)。分析原因，一方面，連作降低了黃連根際土壤的微生物數(shù)量，導(dǎo)致土壤酶活性降低、有機(jī)質(zhì)分解速度減緩，土壤養(yǎng)分含量降低，從而導(dǎo)致作物減產(chǎn)，這與王鵬等[12]的分析結(jié)果類(lèi)似；另一方面，連作破壞了黃連根際土壤的微生態(tài)環(huán)境，促使土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化，病原菌數(shù)量增多、有益菌數(shù)量減少，從而導(dǎo)致病害加重，與洪潔等[13]的結(jié)論相似。本研究結(jié)果表明，伴生栽培對(duì)黃連連作障礙具有一定的緩解效果，小麥、大蔥及黑麥草3種作物伴生栽培中，以大蔥伴生栽培緩解效果最佳，產(chǎn)量較連作3 a的黃連提高67.63%，發(fā)病率降低47.32個(gè)百分點(diǎn)，與趙曉翠[15]、楊瑞娟等[16]、韋持章等[18]結(jié)論一致，這一方面是因?yàn)榘樯耘嗵岣吡它S連根際土壤的細(xì)菌、放線(xiàn)菌含量，從而緩解了因土壤酶活性降低而導(dǎo)致的土壤養(yǎng)分含量不足；另一方面，伴生栽培降低了根際土壤真菌含量，促使連作土壤由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)化，改善了土壤微生態(tài)環(huán)境，從而降低了發(fā)病率。

土壤微生物是反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要參數(shù)，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解等重要的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量交換過(guò)程，其功能多樣性與土壤微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定性密切相關(guān)[19]。根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)受植物根系分泌物調(diào)控，由于植物根系自毒物質(zhì)的積累而導(dǎo)致的微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成連作障礙發(fā)生的主要因素[8-10]。植物間作、套作等栽培制度不僅可以增加地上部的物種多樣性，而且可以通過(guò)根系分泌物對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境起到調(diào)控作用[14，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，連作導(dǎo)致黃連根際土壤細(xì)菌和真菌的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)及Shannon指數(shù)顯著降低，Simpson指數(shù)分別顯著升高30.77%和83.33%(P<0.05)；伴生栽培可顯著提高連作黃連根際土壤細(xì)菌和真菌的多樣性與豐富度，小麥、大蔥及黑麥草3種作物伴生栽培中以大蔥伴生效果最好，根際土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)分別較連作3 a土壤提高11.03%、10.76%、21.53%，Simpson指數(shù)降低17.65%，真菌Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)分別提高54.08%、52.81%、36.41%，Simpson指數(shù)降低15.15%，與胡國(guó)彬等[14]、徐偉慧[17]的研究結(jié)果較為一致。根系分泌物作為土壤微生物的主要能源和碳源，對(duì)土壤微生物具有一定的選擇和塑造作用，其種類(lèi)和數(shù)量決定了微生物的數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)，植物連作導(dǎo)致根系分泌物種類(lèi)過(guò)少、數(shù)量過(guò)多是造成土壤微生物多樣性和豐富度降低的主要原因，而伴生栽培豐富了土壤中根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量，增加了可利用的能源和碳源種類(lèi)，從而提高了土壤微生物的多樣性和豐富度。

不同的栽培制度和農(nóng)藝措施對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯的影響[12-14,18-19]。生菜根際土壤變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度在連作模式下逐漸降低，但是在生菜-菠菜輪作模式中則較為穩(wěn)定，壤霉菌屬、黃桿菌屬及微細(xì)菌屬等有益菌屬成為輪作模式的優(yōu)勢(shì)菌屬[13]。有機(jī)物料可顯著提高設(shè)施番茄長(zhǎng)期連作土壤中變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度，顯著降低酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬及鏈霉菌屬等有益菌屬相對(duì)豐度升高，Gp4、Gp6等不利菌屬相對(duì)豐度降低[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，連作改變了黃連根際土壤細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度，酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)等相對(duì)豐度顯著降低，而厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、接合菌門(mén)和纖毛亞門(mén)等相對(duì)豐度顯著提高；在屬水平，連作顯著降低了紅游動(dòng)菌屬、韋榮球菌屬、支頂孢屬及綠僵菌屬等優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度，而檸檬酸桿菌屬、鏈球菌屬、假霉樣真菌屬及鐮刀菌屬等相對(duì)豐度則顯著升高。這主要是由于黃連根系分泌物不斷積累而導(dǎo)致微生物區(qū)系發(fā)生了重塑。伴生栽培豐富了黃連根際土壤中分泌物的種類(lèi)與數(shù)量，進(jìn)而顯著緩解了連作導(dǎo)致的細(xì)菌、真菌在門(mén)和屬水平的相對(duì)豐度變化，其中以大蔥伴生效果最佳。

土壤微生物菌群豐度與黃連發(fā)病率的相關(guān)性分析結(jié)果表明，假霉樣真菌屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬及檸檬酸桿菌屬等相對(duì)豐度與黃連發(fā)病率呈正相關(guān)，其作用機(jī)制可能是：一方面，該類(lèi)菌群中可能有部分菌群本身就是黃連病害的病原菌；另一方面，該類(lèi)菌群可能通過(guò)分解有機(jī)物、自身代謝等途徑產(chǎn)生促使病原菌侵染植物的物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)病率提高。紅游動(dòng)菌屬、韋榮球菌屬及支頂孢屬等相對(duì)豐度與黃連發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，其抗病機(jī)制可能涉及自身代謝產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖的分泌物、爭(zhēng)奪病原菌養(yǎng)分、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等多個(gè)途徑。因此，今后應(yīng)對(duì)此類(lèi)菌群進(jìn)行深入研究，以期獲得對(duì)黃連病害具有生防作用的微生物菌劑。