王延召，魯曉民，魏良明，周 波，黃 保

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

植物通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來應(yīng)對干旱脅迫，如氣孔關(guān)閉、誘導(dǎo)干旱響應(yīng)基因應(yīng)答等。其中，脫落酸(ABA)作為重要的植物激素之一，參與植物多種生理過程，且對植物適應(yīng)多種非生物脅迫具有重要的調(diào)控作用[1]。干旱脅迫刺激ABA的生物合成[2-3]，但是一直以來對ABA受體的研究較緩慢。RAZEM等[4]通過放射性同位素方法驗證了ABA與FCA蛋白的結(jié)合，但RISK等[5]研究證實FCA蛋白并不結(jié)合ABA。LIU等[6]研究表明，G蛋白偶聯(lián)受體與ABA結(jié)合[7]，但RISK等[5]質(zhì)疑這一結(jié)論。PANDEY等[8]提出，GTGs膜蛋白可以結(jié)合ABA，但仍需要大量的代表性試驗來證實。直到2009年，PYR1基因被鑒定出來，同時證明PYL蛋白與ABA結(jié)合，引起構(gòu)型變化，從而抑制下游PP2C蛋白的磷酸化活性，進而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[9]；之后MA等[10]利用酵母雜交也篩選到可與HAB1(Protein phosphatase 2C16)結(jié)合的PYL5、PYL6、PYL8蛋白。

PYL蛋白被證實是ABA的直接受體后，在擬南芥中鑒定出PYL蛋白家族有14個成員，被分為3個亞家族[11]，隨后，在水稻[12]、草莓[13]、黃瓜[14]、玉米[15]中分別鑒定出12、9、11、13個PYL蛋白，參考擬南芥PYL蛋白家族成員分類將其分為3個亞家族。但不同PYL蛋白的存在形式不同，PYL4、PYL5、PYL6、PYL8、PYL9、PYL10等以單體形式存在，而PYL1、PYL2等以二聚體形式存在。在功能方面，擬南芥中已有報道，除AtPYL13外，其他基因均可激活植物體內(nèi)ABA下游相關(guān)基因的表達[16]；此外，水稻上亦有報道，OsPYL能夠正向調(diào)控ABA信號，提高水稻抗旱和抗鹽堿能力[17-18]。

玉米作為重要的糧食作物，經(jīng)常受到干旱的影響，產(chǎn)量和糧食安全受到嚴重威脅。ABA在植物抵御逆境脅迫中具有重要功能，但目前對ABA受體PYL蛋白的功能報道多集中在擬南芥和水稻上，玉米上關(guān)于ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)對PYL蛋白的影響報道甚少。鑒于此，以玉米為材料，克隆了一個PYL家族基因(Zm00001d010445)，暫時命名為ZmPYL9，分析ZmPYL9編碼蛋白質(zhì)的進化關(guān)系、表達模式及其對干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)情況，并了解該基因的啟動子順式作用元件，預(yù)測該基因特異結(jié)合目標靶基因的DNA片段等，旨在為PYL蛋白家族基因在玉米逆境脅迫和ABA傳導(dǎo)中的作用研究提供參考，為抗逆性強的種質(zhì)資源篩選提供依據(jù)，最終為挖掘抗旱優(yōu)質(zhì)資源、培育抗旱型玉米品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗材料為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供的抗旱性強的玉米自選系鄭H71。取大田正常生長的鄭H71抽雄期的根、莖、芽、葉、雄穗、雌穗、花粉、胚、胚乳，作為測定ZmPYL9基因時空表達的樣品。將鄭H71籽粒播種于營養(yǎng)土，生長至一葉一心時將幼苗從營養(yǎng)土中轉(zhuǎn)移至Hoagland營養(yǎng)液(pH值5.8)中，置于30 ℃光照培養(yǎng)16 h、26 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對濕度為40%～55%的溫室中進行水培。當鄭H71長至三葉一心時，挑選長勢一致的玉米苗分別轉(zhuǎn)移至以下營養(yǎng)液中進行處理：Hoagland營養(yǎng)液(CK)、Hoagland營養(yǎng)液+20% PEG、Hoagland營養(yǎng)液+100 μmol/L ABA、Hoagland營養(yǎng)液+20% PEG+100 μmol/L ABA，分別在處理6、12 h時取各處理幼苗葉片，然后將各處理幼苗轉(zhuǎn)移至新鮮的Hoagland營養(yǎng)液中，恢復(fù)48 h后再次取各處理幼苗葉片。以上所有大田和室內(nèi)樣品5株相同部位葉片混合為1個樣品，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)，且取樣后迅速將其放入液氮，存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 玉米總RNA提取及cDNA合成

利用EasyPure RNA Purification Kit提取鄭H71每個樣品的總RNA，然后根據(jù)TansScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis試劑盒說明書所提供的程序進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.3 ZmPYL9基因cDNA的克隆

用BLAST在線工具搜索ZmPYL9基因序列，設(shè)計特異擴增引物(ZmPYL9-F:5′-ATGGTGGGTCTCGTCGGC-3′和ZmPYL9-R:5′-TCACTGATCGATCAGCGACG-3′)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行擴增，然后將擴增產(chǎn)物連接pMD19-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑選陽性單克隆送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫比對測序結(jié)果。

1.4 ZmPYL9基因的生物信息學(xué)分析

使用在線工具MG2C繪畫玉米數(shù)據(jù)庫中的PYL基因在染色體上的分布；利用在線EXPASY中的Protparam對ZmPYL9基因所編碼蛋白質(zhì)的等電點(pI)、分子質(zhì)量(MW)、穩(wěn)定性、疏水性等屬性進行計算；分別利用TMHMM Server和SOPMA網(wǎng)站對ZmPYL9蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進行分析，使用ExPASy網(wǎng)站的NetPhoS預(yù)測ZmPYL9蛋白的磷酸化位點；采用Plantcare預(yù)測ZmPYL9基因啟動子的順式作用元件；利用MEGA軟件中的NJ法構(gòu)建ZmPYL9蛋白與其他物種同源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹；使用MEME在線分析ZmPYL9蛋白的保守基序(Motif)，基序的最大數(shù)目設(shè)置為8。

1.5 ZmPYL9基因的表達分析

采用qRT-PCR定量分析不同部位和不同處理玉米樣品ZmPYL9基因的表達，設(shè)計基因序列特異熒光引物(ZmPYL9-QF:5′-TCGTCAAGCACATCAAGG-3′和ZmPYL9-QR:5′-AGGCCGGTCTTGACGTTGA-3′)；以玉米18S為內(nèi)參,設(shè)計引物18S1:5′-CCTGCGGCTTAATTGACTC-3′,18S2:5′-GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG-3′。利用CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad,USA)，參考SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)試劑盒程序，采用兩步法進行Real-time PCR。根據(jù)2-△△CT(△CT=CT目標基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT處理后-△CT對照)法進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PYL基因家族在玉米染色體上的分布

圖1顯示了PYL家族基因在玉米10條染色體上的定位。從圖1發(fā)現(xiàn)，除了第7和第10染色體外，PYL家族基因隨機分布在8條染色體上，沒有特殊的染色體偏好。

圖1 ZmPYL基因家族在玉米染色體上的分布

2.2 ZmPYL9基因的克隆和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

利用RT-PCR技術(shù)擴增ZmPYL9基因，得到大小為600 bp左右的特異條帶(圖2)，回收并測序。分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列包含一個完整的594 bp開放閱讀框，編碼197個氨基酸，與全基因組序列已經(jīng)公布的玉米自交系B73的序列一致。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，ZmPYL9分子質(zhì)量為21.79 ku，理論等電點為 5.69，GRAVY值為-0.249，屬于親水性蛋白質(zhì)；跨膜螺旋區(qū)分析結(jié)果顯示，ZmPYL9蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域；SOPMA預(yù)測顯示，ZmPYL9蛋白無規(guī)則卷曲(L)占35.53%，β折疊(E)占3.55%，α螺旋(H)占43.65%，該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主；NetPhoS分析顯示，ZmPYL9蛋白含有8個絲氨酸磷酸化位點、8個蘇氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點，說明ZmPYL9蛋白可能主要受絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶激活，從而調(diào)控下游靶基因的表達，參與植物的生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)及逆境脅迫響應(yīng)過程。

2.3 ZmPYL9蛋白的進化及保守基序分析

為了揭示玉米ZmPYL9基因的進化關(guān)系，利用NJ法構(gòu)建ZmPYL9蛋白序列與其他單子葉和雙子葉植物同源蛋白質(zhì)的進化樹(圖3)，分析發(fā)現(xiàn)，ZmPYL9蛋白與單子葉植物高粱同源蛋白質(zhì)的進化關(guān)系最為緊密，與雙子葉植物大豆和胡桃木的進化關(guān)系較遠。為了進一步分析ZmPYL9蛋白及其他物種同源蛋白質(zhì)的保守性，利用MEME軟件共鑒定了8個保守基序。由圖3可知，玉米與高粱不僅同源性較高，且在相同的氨基酸位置含有相同的6個保守基序；與大豆和胡桃木的進化較遠，其含有的保守基序相差較大。說明進化關(guān)系密切的物種保守功能基序也較為一致。

M為Trans5K DNA Marker，泳道1為ZmPYL9基因PCR擴增產(chǎn)物

8種顏色代表8個不同的保守基序；Zm00001d010445代表玉米；Sb09g006700代表高粱；Bradi2g32250代表二穗短柄草；AT5G53160代表擬南芥；LOC Os05g12260代表水稻；Pavir.Ca00496代表柳枝稷；Seita.3G076200代表谷子；Pahal.C00916代表胡桃木；Glyma07g06270代表大豆Eight colors represent eight different conservative motifs；Zm00001d010445 stands for Zea mays L.;Sb09g006700 stands for Sorghum bicolor (Linn.) Moench;Bradi2g32250 stands for Brachypodium distachyum (L.) Beauv.;AT5G53160 stands for Arabidopsis;LOC Os05g12260 stands for Oryza latifolia Desv.;Pavir.Ca00496 stands for Panicum virgatum Linn.;Seita.3G076200 stands for Setaria italica (L.) Beauv.;Pahal.C00916 stands for walnut;Glyma07g06270 stands for Glycine max (Linn.) Merr.圖3 ZmPYL9蛋白與其他物種同源蛋白的進化樹及保守基序

2.4 ZmPYL9基因啟動子順式元件分析

為了進一步解析ZmPYL9的潛在功能，分析ZmPYL9基因ATG上游2 000 bp的順式響應(yīng)元件(表1)，發(fā)現(xiàn)該基因含有多種功能元件，除了啟動子本身核心元件TATA-box、CAAT-box外，還包含如ARE、AuxRR-core、CGTCA-motif、DRE core、ERE、GC-motif、STRE、TCA-element等結(jié)合位點。其中，ARE和GC-motif是厭氧誘導(dǎo)必不可少的響應(yīng)元件；AuxRR-core屬于生長素響應(yīng)因子，在胚乳、子葉和側(cè)根發(fā)育中起重要作用；CGTCA-motif和TCA-element參與茉莉酸和水楊酸信號途徑；DRE core、ERE和STRE響應(yīng)多種非生物脅迫。另外，還發(fā)現(xiàn)大量光刺激應(yīng)答元件(AT1-motif、GA-motif、Sp1)。推測ZmPYL9不僅響應(yīng)逆境脅迫和激素信號傳導(dǎo)途徑，可能還參與植物光合作用和調(diào)控植物開花等光反應(yīng)。

表1 ZmPYL9基因啟動子順式元件分析Tab.1 The cis element analysis of ZmPYL9 gene promoter

2.5 ZmPYL9基因的組織表達模式分析

為了解ZmPYL9基因的表達模式，利用qRT-PCR分析該基因在不同組織中的表達情況(圖4)，結(jié)果顯示，ZmPYL9基因在根、莖、葉、雌穗、雄穗、花粉、胚、胚乳中均有表達，但在胚乳中表達量最高，其次是雄穗和根?？梢?，ZmPYL9基因?qū)儆诮M成型表達基因，但在不同部位的表達量存在一定的差異。

R.根;S.莖;L.葉;T.雄穗;E.雌穗;P.花粉;Eb.胚;Ed.胚乳

2.6 ZmPYL9基因?qū)EG脅迫和ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)模式

由圖5可見，ABA誘導(dǎo)6、12 h時，ZmPYL9表達量均高于CK，但恢復(fù)48 h后ZmPYL9相對表達量低于CK；PEG和PEG+ABA脅迫6、12 h時，ZmPYL9表達量均低于CK，但恢復(fù)48 h后ZmPYL9表達量上升且PEG脅迫處理的ZmPYL9表達量遠高于CK；同時發(fā)現(xiàn)，ABA+PEG脅迫較PEG脅迫提高了該基因的表達量，也就是說外源ABA可以提高干旱脅迫下ZmPYL9基因的表達量。說明ZmPYL9基因響應(yīng)干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)，且受ABA的正向誘導(dǎo)，受PEG和PEG+ABA脅迫的負向誘導(dǎo)。

圖5 ZmPYL9基因響應(yīng)干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)模式

3 結(jié)論與討論

玉米是重要的糧食、飼料、加工原料等，其需求量越來越大。近年來，干旱導(dǎo)致的玉米產(chǎn)量下降已成為急需解決的嚴峻問題。篩選抗旱玉米種質(zhì)資源并挖掘其自身的抗旱優(yōu)質(zhì)分子資源是一條有效的解決手段。植物可通過ABA信號途徑應(yīng)對干旱脅迫，如關(guān)閉氣孔、誘導(dǎo)干旱基因應(yīng)答等方式。PYL基因作為ABA受體，直接影響ABA的生物合成。目前，關(guān)于玉米PYL家族基因的抗旱功能研究報道甚少，基于此，本研究克隆了一個ZmPYL9基因，編碼197個氨基酸，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主，且該蛋白質(zhì)可能主要被絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶激活，從而調(diào)控下游靶基因的表達，參與植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程。系統(tǒng)進化及保守基序分析發(fā)現(xiàn)，ZmPYL9蛋白與高粱不僅同源性較高，且基序一致，進化關(guān)系較為緊密；與大豆和胡桃木的進化關(guān)系較遠，含有的保守基序相差較大。說明物種間的進化關(guān)系與其保守功能基序較為一致。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，ZmPYL9基因啟動子區(qū)域存在多個順式元件，說明ZmPYL9基因的表達可能受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，且這些轉(zhuǎn)錄因子與多種信號途徑相關(guān)。這些順式元件包含生長素、茉莉酸、水楊酸等多種激素的應(yīng)答元件，說明ZmPYL9基因的表達除響應(yīng)ABA外，還受其他激素的調(diào)節(jié)，參與多種激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。但前人研究表明，與激素應(yīng)答相關(guān)的順式元件存在冗余的可能，這一結(jié)論在水稻和擬南芥上均有驗證[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZmPYL9基因在玉米多個組織中均存在表達，說明該基因?qū)儆诮M成型表達基因。該結(jié)果與擬南芥AtPYL3、AtPYL10、AtPYL11、AtPYL12和AtPYL13的研究結(jié)論一致[20]，但與AtPYL8[21]不同。SAAVEDRA等[21]研究表明，AtPYL8基因表達具有時空特異性，只在根中表達，說明PYL家族基因在表達模式上有所區(qū)別。

ZmPYL9基因正向響應(yīng)外源ABA誘導(dǎo)，而恢復(fù)正常培養(yǎng)后，該基因表達量急速下降且低于CK，說明ZmPYL9基因確實參與ABA信號途徑；ZmPYL9基因被PEG和PEG+ABA負向誘導(dǎo)，且PEG+ABA脅迫下表達量高于PEG脅迫，而恢復(fù)正常培養(yǎng)后，2種脅迫下ZmPYL9表達量均表現(xiàn)上升趨勢，說明ZmPYL9基因響應(yīng)干旱脅迫，且ABA可以提高干旱脅迫下該基因的表達量。前人對PYL家族基因的功能研究發(fā)現(xiàn)，OsPYL5過表達的轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量降低[18]；AtPYL4基因過表達導(dǎo)致擬南芥幼苗的蓮座葉變小[22]；AtPYL5、AtPYL8和AtPYL9的過量表達不僅能夠顯著提高植物在種子萌發(fā)、幼苗生長等階段對ABA的敏感性，而且還能提高植物的抗旱能力[21,23]。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PYL基因雖提高了植物的抗旱性，但也會帶來一些不良影響，因此在轉(zhuǎn)基因的過程中要盡可能地不影響植物的其他優(yōu)良性狀。