胡雙慶， 袁哲軍,2， 沈根祥*

1.上海市環(huán)境科學研究院， 上海 200233

2.上海紡織節(jié)能環(huán)保中心， 上海 200082

規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖業(yè)在快速發(fā)展的同時也給環(huán)境帶來了雌激素污染風險. 據估計，環(huán)境中90%的天然雌激素來源于畜禽動物排泄物[1-2]，且排泄物中雌激素的種類和含量因畜禽動物類型、性別及其生長發(fā)育階段的不同而存在差異[3]，豬和家禽主要通過尿液排放雌激素，而奶牛和羊主要通過糞便排放雌激素[4]，豬主要排放E1(estrone，雌酮)、E2(17β-estradiol，雌二醇)和E3(estriol，雌三醇)，而奶牛主要排放E1和E2[3,5]. 人工合成雌激素炔雌醇(17β-ethinylestradiol，EE2)和己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)因具有促進動物生長和體質量增加的作用，而被用作激素類藥物或飼料添加劑應用到畜禽養(yǎng)殖過程中. 進入環(huán)境中的天然和人工合成雌激素具有很強的內分泌干擾活性[6-7]，如它們能夠在ngL痕量水平誘導雄魚雌性化[8-9]，致使魚類胚胎發(fā)育遲滯和畸形[10-11]，脅迫微生物群落結構發(fā)生改變[12-13]. 因此，畜禽養(yǎng)殖業(yè)雌激素污染風險應當引起足夠重視.

近年來，畜禽養(yǎng)殖業(yè)雌激素污染及其控制逐漸成為研究熱點[14-16]. 目前對河流水體中雌激素污染特征進行研究的報道[17-19]較多，但對畜禽養(yǎng)殖場雌激素的排放特征研究報道相對較少. 再者，畜禽糞污基質較為復雜，樣品前處理難度大，這給畜禽糞污雌激素研究帶來了挑戰(zhàn). 上海市畜禽養(yǎng)殖規(guī)模大、養(yǎng)殖類型多樣化，養(yǎng)殖過程雌激素污染風險不容忽視. 因此，該研究通過建立固相萃取-高效液相色譜串聯質譜(SPE-HPLC-MSMS)分析方法，對上海市典型畜禽養(yǎng)殖類型排放的5種天然和人工合成雌激素(E1、E2、E3、EE2和DES)進行定量檢測，分析其總體分布特征和檢出水平，并通過比較畜禽排泄物經處理設施處理前后雌激素含量水平的差異，分析不同處理方式下雌激素的去除效率，以期為畜禽養(yǎng)殖雌激素污染風險管控提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

儀器：5500Q-trap高效液相色譜串聯質譜儀(美國AB公司)，配MultiQuant 3.0.2軟件；12通道固相萃取裝置(美國Waters公司)；超聲波清洗器(KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司)；pH計(S220，梅特勒-托多儀器(上海)有限公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；氮吹儀(Anpel 12通道，上海安譜實驗科技股份有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(艾卡儀器設備有限公司上海分公司)；微波萃取儀(MARS CLSSIC，美國CEM公司)；低溫真空冷凍干燥機(上海昊博低溫真空有限公司).

試劑：甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷均為HPLC級，均購自美國Tedia公司. E1(雌酮，純度為99.3%，)、E2(17β-雌二醇，純度為97.5%)、E3(雌三醇，純度為99.5%)、EE2(炔雌醇，純度為99.0%)、DES(己烯雌酚，純度為99.5%)、17β-E2-d3(17β-雌二醇-d3，純度為98.0%)、EE2-d4(炔雌醇-d4，純度為98.0%)和DES-d8(己烯雌酚-d8，純度為98.0%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司. 上述標準品均用甲醇配成標準儲備液. 混和標準溶液中5種物質的含量均為100 mgL. 根據需要用甲醇配制標準工作溶液，于4 ℃冰箱中保存.

1.2 樣品的采集與保存

選擇上海市畜禽養(yǎng)殖業(yè)相對集中的區(qū)域，針對3種不同養(yǎng)殖類型(豬、奶牛、雞)分別采集糞便、尿液、有機肥和污水樣品，向樣品中加入4 molL的鹽酸防止微生物對目標物質的降解作用. 樣品快速運回實驗室后，放入-20 ℃冰箱冷凍保存. 試驗前取出解凍，糞便樣品經低溫真空冷凍干燥機干燥24 h后待用. 不同畜禽養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖規(guī)模、糞便污水處理方式等基本信息見表1.

表1 不同畜禽養(yǎng)殖場養(yǎng)殖規(guī)模及糞污處理方式

注： 1)豬和奶牛養(yǎng)殖量的單位為頭a，雞養(yǎng)殖量的單位為羽a.

1.3 液體樣品前處理方法

分別量取10 mL尿液樣品和100 mL污水樣品，用超純水稀釋至500 mL，水樣經玻璃纖維濾紙(孔徑0.7 μm)過濾后，在每個樣品中均加入100 ng的3種內標物質(17β-E2-d3、EE2-d4和DES-d8)，其中，17β-E2-d3 作為E1、E2和E3內標，EE2-d4作為EE2內標，DES-d8作為DES內標. 調水樣pH為3，進行Oasis HLB柱(200 mg，6 mL，美國Waters公司)固相萃取凈化. 依次用6 mL甲醇、6 mL水活化HLB固相萃取小柱. 上樣速率為3～6 mLmin，上樣結束后，依次用5 mL超純水、5 mL 5%的甲醇水溶液淋洗小柱，減壓抽干10 min，最后用10 mL甲醇分兩次洗脫[20]. 洗脫液在40 ℃下氮吹至近干，用8 mLV(正己烷)∶V(二氯甲烷)為3∶1的溶液重新溶解，進行Florisil固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國Waters公司)凈化，用5 mL二氯甲烷和5 mLV(正己烷)∶V(二氯甲烷)為 3∶1 的溶液先后進行活化，樣品過柱流速為1 mLmin，過柱完后，用6 mLV(甲醇)∶V(二氯甲烷)為1∶4的溶液進行洗脫，洗脫液氮吹至近干. 用1 mLV(甲醇)∶V(水)為7∶3的溶液重新溶解，過0.22 μm微孔濾膜到進樣瓶中，進行SPE-HPLC-MSMS測定.

1.4 固體樣品前處理方法

稱取糞便、有機肥和土壤樣品各5.0 g(干質量)，分別加入100 ng內標物. 利用微波輔助萃取(MAE)方法提取固體樣品中的雌激素. 微波萃取劑選取50 mLV(甲醇)∶V(丙酮)為1∶3的溶液，萃取溫度為100 ℃，萃取功率為800 W，萃取時間梯度設置為溫度爬升10 min，保持30 min，降溫20 min. 萃取結束后，轉移所有上清液于100 mL玻璃瓶中，轉移至旋轉蒸發(fā)儀(40 ℃，80 rmin，-75 kPa)中濃縮至10 mL，經氮吹儀吹至近干. 用5 mL乙腈重新溶解，然后加入5 mL正己烷進行液-液萃取(LLE)后，移除正己烷層，該操作重復兩遍，以除去油類物質. 所得乙腈層溶液用超純水稀釋至500 mL，調節(jié)pH至3. 然后經Oasis HLB柱固相萃取凈化，操作同1.3節(jié)液體樣品處理方法.

1.5 HPLC-MSMS分析

采用AB 5500 Q-trap高效液相色譜串聯質譜儀(美國AB公司)，配島津30A液相色譜，對5種目標雌激素進行檢測. 其中，色譜柱選用Shim-Pack XR-ODSII C18(100 mm×2 mm，1.0 μm)型號，流動相為0.1%氨水和乙腈. 5種雌激素高效液相色譜-串聯質譜分析條件見表2.

表2 高效液相色譜-串聯質譜分析參數

1.6 質量保證和質量控制

用甲醇溶液配制5種雌激素的系列混合標準溶液，ρ(雌激素)為1.0～500 μgL，采用內標法定量，向進樣瓶中分別加入100 ng的17β-E2-d3、EE2-d4和DES-d8內標液，在選定的色譜和質譜條件下進行測定，得到5種雌激素的線性相關系數(r2)均大于0.995，表明所建立的線性關系良好. 在該方法條件下獲得各目標物的LOD(檢測限)范圍為0.17～1.57 μgL，LOQ(定量限)范圍為0.57～5.25 μgL.

選擇4種環(huán)境樣品(糞便、有機肥、尿液、污水)，設置100和500 ng兩個加標水平進行加標回收率試驗. 按1.3節(jié)和1.4節(jié)優(yōu)化的前處理方法進行萃取、凈化和濃縮，用1.5節(jié)建立的分析方法測定各目標物的含量，并計算回收率與相對標準偏差(見表3)，得到糞便樣品中目標物回收率范圍為61.3%～91.2%，相對標準偏差小于7.1%；有機肥樣品回收率為66.2%～106.3%，相對標準偏差小于6.9%；尿液樣品回收率范圍為65.4%～102.2%，相對標準偏差小于7.5%；污水樣品回收率范圍為64.8%～89.9%，相對標準偏差小于6.5%；表明所建立的方法對畜禽糞污環(huán)境樣品中雌激素的檢測分析具有良好的準確度和精密度.

表3 不同環(huán)境樣品中雌激素的回收率和相對標準偏差(n=3)

2 結果與討論

2.1 畜禽排泄物中雌激素總體分布特征

2.1.1畜禽糞便和有機肥中各雌激素檢測水平

分別對采集的18個糞便樣品(含平行樣，包括9個奶牛糞、6個豬糞和3個雞糞樣品)和18個有機肥樣品(含平行樣，包括3個奶牛場堆肥、6個奶牛場沼渣肥、6個豬場沼渣肥和3個雞場堆肥樣品)中5種雌激素含量進行了測定(見圖1).

注： 箱式圖中上下水平線分別代表最小值和最大值；×代表第1和99百分位數；箱子上下底和中間水平線分別代表第25、75和50百分位數；含量平均值用小方塊()表示.

由圖1可見，糞便樣品中天然雌激素w(E1)、w(E2)和w(E3)范圍分別為26.5～55.5、19.1～45.2和nd～16.3 ngg，檢出率分別為100%、100%和50%；人工合成雌激素w(EE2)和w(DES)范圍分別為nd～8.3和nd～11.2 ngg，檢出率分別為83.3%和66.7%. ZHANG等[14]對上海市和浙江省13個畜禽養(yǎng)殖場進行了布點采樣，測得糞便樣品中w(E1)、w(E2)、w(E3)和w(EE2)的范圍分別為nd～12.8、nd～101.0、nd～13.1和nd～10.4 ngg，表明兩個地區(qū)雌激素檢出情況相似，對比分析表明，上海市畜禽養(yǎng)殖業(yè)雌激素排放水平較穩(wěn)定. 另外，該研究發(fā)現，E3僅在豬糞和雞糞中被檢出，奶牛糞便中未檢出E3，這與奶牛主要分泌雌激素E1和E2、并不產生E3的研究報道[21]相一致，這進一步證明了環(huán)境中雌激素種類和畜禽養(yǎng)殖類型的相關性. 在畜禽排泄物中檢出人工合成雌激素EE2和DES，分析原因可能是EE2和DES被作為動物飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，最終會隨畜禽排泄物進入環(huán)境中.

由圖1可見，有機肥樣品中w(E1)、w(E2)、w(E3)、w(EE2)和w(DES)范圍分別為3.8～16.3、1.5～10.5、nd～4.2、nd～4.8和nd～5.4 ngg，檢出率分別為100%、100%、50%、66.7%和33.3%. 與糞便樣品相比，有機肥樣品中雌激素總體含量明顯降低，各雌激素檢出范圍縮小，且人工合成雌激素EE2和DES的檢出率也有所降低. 綜合分析表明，糞便經過有機肥處理過程后，其中的雌激素會發(fā)生降解，從而其含量下降，檢出率降低.

2.1.2尿液和污水中各雌激素檢測水平

分別對采集的15個尿液樣品(含平行樣，9個奶牛尿液樣品和6個豬尿樣品)和18個污水樣品(含平行樣，3個奶牛場污水進水、3個奶牛場污水出水、6個奶牛場厭氧發(fā)酵污水和6個豬場厭氧發(fā)酵污水樣品)中5種雌激素含量進行測定，各雌激素檢出情況如圖2所示.

圖2 尿液和污水樣品中5種雌激素的含量范圍Fig.2 The concentration ranges of five estrogens in animal urine and sewage samples

尿液樣品天然雌激素ρ(E1)、ρ(E2)和ρ(E3)范圍分別為 1 087.0～4 380.3、1 144.5～3 640.0 和nd～ 1 322.1 ngL；污水樣品中分別為391.5～3 735.0、169.8～1 201.4 和nd～170.3 ngL，各雌激素的檢出含量較高，檢出范圍較寬. Raman等[22]發(fā)現某豬場氧化塘中ρ(E1)和ρ(E2)分別為 5 900.4～14 000.6 和 1 800.5～3 300.2 ngL，然而ZHENG等[23]發(fā)現某畜禽場污水處理設施中雌激素物質總量低于5.0 ngL. 分析原因，可能與畜禽養(yǎng)殖類型和畜禽動物生長期、污水處理方式和處理程度的差異有關，導致天然雌激素的含量水平差異較大，檢出范圍較寬. E1、E2、E3和DES在尿液和污水樣品中的檢出率相近. EE2在尿液樣品中未被檢出，但在污水樣品中檢出率達到100%，ρ(EE2)范圍為4.8～81.7 ngL. LIU等[24]發(fā)現，某養(yǎng)殖場經處理的污水中ρ(EE2)為124～285 ngL，而未經處理的污水中ρ(EE2)高達410 ngL；ZHANG等[14]測得某豬場氧化塘污水中ρ(EE2)為155 ngL. 然而，也有相關文獻報道[25-26]EE2含量低于檢測限. 因此，污水中EE2會因處理設施和處理程度的不同，而引起降解率出現較大差異.

2.2 典型畜禽場雌激素的排放狀況

2.2.1典型豬場雌激素排放情況

對某規(guī)?；B(yǎng)豬場進行加密布點采樣，共采集5種樣品——糞便、沼渣肥、還田土壤、尿液以及沼液樣品，這些樣品中雌激素含量如表4所示，5種雌激素總量分布見圖3.

表4 典型豬場樣品中5種雌激素含量(n=3)

注：—表示未檢出. 加粗數值單位為ngg，非加粗數值單位為ngL.

注： 糞便、沼渣肥、還田土壤樣品中雌激素含量單位為ngg；尿液和沼液中雌激素含量單位為ngL.

天然雌激素E1在糞便和尿液樣品中檢出含量均為最高，分別占樣品中雌激素總量的45%和48%，這與Johnson等[27-28]發(fā)現E1是豬排泄物中最主要的雌激素結果相符. 該養(yǎng)豬場糞污處理利用方式為沼氣工程模式，主要通過厭氧發(fā)酵生產沼氣，并產生沼液和沼渣肥. 由圖3可見，豬場糞便和尿液中雌激素總量分別為94.5 ngg和 8 882.2 ngL，糞污經處理后產生的沼渣肥和沼液中雌激素總量分別為35.1 ngg和 4 388.6 ngL，還田土壤中雌激素總量為0.1 ngg，表明該養(yǎng)豬場厭氧發(fā)酵處理工藝對豬場污水中雌激素的去除效果一般，未被去除的雌激素會隨糞肥還田進入農田土壤，給農田土壤環(huán)境帶來雌激素污染風險，相關研究[14]發(fā)現，組合式氣浮污水處理設施對畜禽排泄物中雌激素的去除率高達97%，其中對E1和E2的去除率達100%，而厭氧發(fā)酵處理對雌激素的去除率低于50%. 對比分析表明，污水處理設施的去除效率可能與糞污處理過程中的好氧-缺氧環(huán)境有關，好氧環(huán)境能夠促進雌激素的吸附和降解[29]，而缺氧(厭氧)狀態(tài)下雌激素的降解受到抑制，EE2甚至不能得到降解[30-31]. 因此，為了加強對豬養(yǎng)殖過程雌激素排放的污染管控，可通過優(yōu)化養(yǎng)殖場糞污處理利用方式，提高糞污中雌激素的去除效果，從而降低雌激素進入周邊環(huán)境的風險.

2.2.2典型奶牛場雌激素排放情況

對某規(guī)?；膛鲞M行加密布點采樣，共采集6種樣品——糞便、尿液、堆肥、污水進水、污水出水(污水采用厭氧-好氧凈化處理)和還田土壤樣品，這些樣品中5種雌激素含量如表5所示.

表5 典型奶牛場樣品中5種雌激素含量(n=3)

注： —表示未檢出. 加粗數值單位為ngg，非加粗數值單位為ngL.

注： 糞便、堆肥、還田土壤樣品中雌激素含量單位為ngg，尿液、污水進水和污水出水中雌激素含量單位為ngL.

在奶牛場糞便和尿液樣品中E1和E2的含量均較高，分別占糞便樣品中雌激素總量的61%和25%以及尿液樣品中雌激素總量的41%和57%，表明E1和E2是奶牛排泄物中最主要的雌激素，這與Hanselman等[3-4]研究奶牛排泄物中雌激素的分布結果相一致. 研究報道[7，32]顯示，E2具有很強的內分泌干擾活性，故應加強對奶牛養(yǎng)殖業(yè)糞污雌激素污染風險的管控. 由圖4可見，奶牛糞便和尿液中雌激素總量分別為84.6 ngg和2 636.7 ngL，比豬糞和豬尿中低12%和70%，表明豬排泄物中雌激素含量高于奶牛排泄物. 糞便經高溫好氧堆肥后，雌激素總量為16.2 ngg，下降了81%，其中E1和E2含量顯著降低. ZHANG等[33]研究顯示，堆肥處理對奶牛糞便中雌激素的去除率達55.8%；ZHENG等[23]研究發(fā)現，糞便經堆肥3個月后，雌激素的去除率高達80%. 對比分析表明，該奶牛場的好氧堆肥處理方式可有效去除固體糞便中的雌激素. 在還田土壤樣品中，雌激素總量為0.1 ngg，只有DES以較低含量被檢出，其他雌激素均未被檢出. 由于土壤環(huán)境中存在各種吸附和降解作用[34]，使得進入土壤中的雌激素含量降低. 污水經處理設施處理后，雌激素總量由 2 605.6 ngL降至615.7 ngL，E1、E2和EE2含量顯著降低，去除率分別達72%、82%和84%，且在污水出水中DES含量低于檢測限. 該奶牛場污水經場區(qū)內預處理達到納管標準后接入污水處理廠污水收集管網，采用的污水處理方式為厭氧-好氧凈化處理. 這表明該污水處理方式對天然和人工合成雌激素均具有較高的去除效果，可能是微生物厭氧與好氧降解以及污泥吸附等共同作用的結果[24].

2.2.3典型雞場雌激素排放情況

圖5 典型雞場樣品中5種雌激素含量Fig.5 The concentration distribution of five estrogens in the samples from the chicken farm

對某規(guī)?；B(yǎng)雞場進行平均布點采樣，共采集3種樣品，包括糞便、堆肥和還田土壤樣品，這些樣品中雌激素含量如圖5所示. 雞場雌激素的排放特征與豬場和奶牛場有較大差異. 雞主要排泄固體糞便，產生的尿液量很少，因此該研究未采集液體樣品. 雞糞樣品中5種雌激素均被檢出，總量達60.9 ngg，比豬糞和奶牛糞雌激素總量低36%和28%，表明雞對環(huán)境中雌激素的貢獻率遠低于豬和奶牛. 堆肥樣品中未檢出EE2，其他4種雌激素總量為17.5 ngg，相較于糞便樣品雌激素總量下降71%，表明雌激素在高溫堆肥過程中得到了較好的降解. 5種雌激素在雞糞還田土壤中均未被檢出.

3 結論

a) 上海市典型豬場、奶牛場和雞場排泄物中均含有一定數量的天然和人工合成雌激素，其中，豬場糞便和尿液中5種雌激素總量分別為94.5 ngg和 8 882.2 ngL，奶牛場糞便和尿液中總量分別為84.6 ngg和 2 636.7 ngL，雞場糞便中總量為60.9 ngg.

b) E1為豬排泄物中最主要的雌激素，分別占糞便和尿液樣品中雌激素總量的45%和48%，E1和E2為奶牛排泄物中最主要的雌激素，分別占糞便樣品中總量的61%和25%，占尿液樣品中總量的41%和57%，且通過糞便和尿液向環(huán)境中排放的5種雌激素總量表現為豬場>奶牛場>雞場.

c) 厭氧發(fā)酵處理對豬場污水中雌激素具有一定的去除效果，經處理后沼液中雌激素總量降至 4 388.6 ngL，固體糞高溫堆肥和污水厭氧-好氧凈化處理對奶牛排泄物中雌激素具有較好的去除效果，糞便經堆肥處理后雌激素總量降至16.2 ngg，污水經處理后雌激素總量降至615.7 ngL.