李 焱，黃 葦,，盧明劍，胡志敏，呂秋潔

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510642）

生物代謝過(guò)程中會(huì)不斷地產(chǎn)生自由基，自由基產(chǎn)生和消除之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，生物體將處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[1]。過(guò)量積累的自由基會(huì)通過(guò)氧化作用破壞細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，造成細(xì)胞的氧化損傷[2]，導(dǎo)致生物體的細(xì)胞凋亡、組織受損。生物體利用內(nèi)源性和外源性抗氧化物質(zhì)來(lái)防止細(xì)胞的氧化損傷[3]。黃酮類化合物具有抗菌[4]、抗氧化自由基[5]、抗癌[6]等藥理活性，作為外源性抗氧化劑在食藥方面的應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)。

紫果西番蓮（Passiflora edulisSims）屬西番蓮科，廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)，其果汁香味濃郁，主要用于生產(chǎn)飲料。西番蓮果的種籽占整果質(zhì)量的4%～12%，含油量約占27%[7-8]，但在果汁加工中一般被作為廢物丟棄。黃酮存在于西番蓮全草的不同部位，已有研究表明，其葉片中含有葒草素、異牡荊素[9]、木樨草素-7-O-葡萄糖苷[10]等，莖中含有白楊素、木樨草素[11]等，果皮中含有芹菜素-8-C-β-二氧吡啉[12]等；其種籽中也含有相當(dāng)豐富的黃酮[13]，但對(duì)其種籽黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及具體成分研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)用紫果西番蓮種籽黃酮灌胃D-半乳糖氧化損傷模型小鼠，測(cè)定總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白質(zhì)羰基含量等多種生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)西番蓮種籽黃酮作為外源性抗氧化劑的體內(nèi)抗氧化活性，并采用液相色譜-電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography coupled with electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometry，LC-ESI-Q-TOF-MS）技術(shù)對(duì)其成分構(gòu)成進(jìn)行分析，推測(cè)出可能的裂解途徑，以期為紫果西番蓮種籽的深入開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠60 只，體質(zhì)量（20f 2）g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。

紫果西番蓮品種為‘紫香一號(hào)’，購(gòu)自廣州市天平架市場(chǎng)。

AB-8大孔樹(shù)脂 東鴻化工有限公司；T-SOD、MDA、CAT、GSH-Px、蛋白質(zhì)羰基試劑盒 南京建成生物工程有限公司；甲醇、甲酸（均為色譜純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；D-半乳糖、VC等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6540B LC-ESI-Q-TOF-MS儀 美國(guó)安捷倫公司； 12ND冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限 公司；HL-2B恒流泵 上海滬粵科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種籽黃酮的制備

1.3.1.1 種籽黃酮的提取

參考文獻(xiàn)[13]的方法，西番蓮果取汁后，種籽漂洗干凈，于55 ℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)孔徑0.425 mm篩。稱取適量干燥的種籽粉末，加入石油醚進(jìn)行提油（85 ℃冷凝回流70 min），揮發(fā)干凈石油醚，得種籽油粕。稱取種籽油粕樣品，每克種籽油粕樣品加入56.02 mL體積分?jǐn)?shù)73.78%的乙醇溶液，于超聲溫度80 ℃（冰水循環(huán)）、超聲功率300 W條件下提取50 min，再置于微波處理器中，設(shè)置微波功率160 W，提取90 s。提取完畢后抽濾，濃縮至無(wú)乙醇味，真空冷凍干燥得總黃酮粗提物，備用。種籽黃酮粗提物的提取量為（117.53f 0.42）mg/g。

1.3.1.2 種籽黃酮的純化

預(yù)處理AB-8大孔樹(shù)脂，配制1.3.1.1節(jié)中的黃酮粗提液（質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL），調(diào)節(jié)上樣液的pH值為3， 以9 r/min流速上樣120 mL，再用150 mL的蒸餾水以 6 r/min流速淋洗，之后用90 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液以12 r/min流速進(jìn)行洗脫。取洗脫液濃縮至無(wú)乙醇味，真空冷凍干燥得到純化總黃酮，備用。種籽黃酮經(jīng)純化后純度為（70.14f 0.12）%。

1.3.2 種籽黃酮體內(nèi)抗氧化活性的評(píng)價(jià)

1.3.2.1 小鼠分組與處理

參照[2012]107號(hào)《關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評(píng)價(jià)方法等9 個(gè)保健功能評(píng)價(jià)方法的通知》中抗氧化功能評(píng)價(jià)方法[14]及羅磊等[15]的方法設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以氧化損傷模型小鼠評(píng)價(jià)種籽黃酮體內(nèi)抗氧化活性。小鼠適應(yīng)性飼喂一周后，隨機(jī)分為6 組（每組10 只），設(shè)定為空白組、模型組、VC組及種籽黃酮低、中、高劑量組。除空白組皮下注射生理鹽水外，其余各組均按200 mg/（kgg d）注射D-半乳糖進(jìn)行造模，各組連續(xù)注射30 d，以構(gòu)建D-半乳糖氧化損傷模型。造模的同時(shí)，種籽黃酮各劑量組分別按60、120、240 mg/（kgg d）劑量灌胃純化總黃酮，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃100 mg/（kgg d）VC，空白組和模型組灌胃生理鹽水。注射及灌胃體積均為0.1 mL/10 gmb，每日1 次，實(shí)驗(yàn)期間所有小鼠不限制攝食及飲水。

1.3.2.2 組織樣品的制備

末次灌胃后，全部小鼠禁食12 h，摘眼球取血后脊椎脫臼法處死小鼠，取肝、腎以預(yù)冷的生理鹽水漂洗，濾紙吸干。用冰生理鹽水在4 ℃條件下勻漿組織，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的初始樣品。于4 ℃、4 500 r/min下離心10 min后取上清液，－20 ℃保存待測(cè)。

1.3.2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

小鼠肝、腎組織中的T-SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 種籽黃酮成分的分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mmh 4.6 mm ，5 μm）。流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL。采用二元高壓梯度洗脫，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.25%甲酸溶液。洗脫程序：0～10 min，15%～45% A；10～20 min，4 5%～6 0% A；2 0 ～3 5 m i n，6 0%～1 0 0% A；35～40 min，100%～15% A。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離正離子模式下采集數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；毛細(xì)管電壓100 V；霧化氣壓力45 psi；干燥器流量9 L/min；干燥氣溫度300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 種籽黃酮體內(nèi)抗氧化活性的評(píng)價(jià)結(jié)果

SOD是一類金屬酶，其活力能反映出細(xì)胞免受氧化損傷的能力[16]。CAT可催化H2O2分解為H2O和O2，增強(qiáng)機(jī)體抗自由基的能力[17]。GSH-Px催化GSH與H2O2生成氧化型谷胱甘肽，其經(jīng)GSH還原酶作用，接受H＋還原成GSH，GSH-Px通過(guò)上述作用保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能不受氧化損傷[18]。MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用形成的最終產(chǎn)物之一，其含量可反映機(jī) 體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的程度，從而間接反映細(xì)胞損傷的程度[19]。蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是其發(fā)生氧化損傷的重要標(biāo)志，自由基攻擊氨基酸分子中游離氨基或亞氨基最終產(chǎn)生羰基衍生物，其含量反映了細(xì)胞氧化程度[20-21]。

表 1 小鼠肝組織中T-SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、 蛋白質(zhì)羰基含量Table 1 Effect of total falvonoids from the seeds of Passifolra edulis Sims on T-SOD, CAT and GSH-Px activities and MDA and protein carbonyl contents in liver tissue of mice

表 2 小鼠腎組織中T-SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA、 蛋白質(zhì)羰基含量Table 2 Effect of total falvonoids from the seeds of Passifolra edulis Sims on T-SOD, CAT and GSH-Px activities and MDA and protein carbonyl contents in kidney tissue of mice

由表1、2可知，模型組小鼠肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著低于空白組（P＜0.05），而MDA、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著高于空白組（P＜0.05），表明模型組小鼠發(fā)生了氧化損傷，D-半乳糖氧化損傷模型建造成功。

以中、高劑量種籽黃酮灌胃小鼠后，除了中劑量組小鼠的肝組織CAT活力和腎組織T-SOD活力以外，其余中、高劑量組小鼠肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著高于模型組（P＜0.05）。與模型組相比，中劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的T-SOD活力提高了50.51%、CAT活力提高18.01%、GSH-Px活力提高29.62%，高劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的這3 種抗氧化酶活力分別提高了69.40%、38.57%、46.38%；中劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的T-SOD活力提高了0.01 倍、CAT活力提高了0.90 倍、GSH-Px活力提高了0.77 倍，高劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的這3 種抗氧化酶活力分別提高了0.36、1.39、1.41 倍。以上結(jié)果表明，肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力與種籽黃酮的灌胃劑量存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，種籽黃酮?jiǎng)┝吭酱螅? 種抗氧化酶活力越高。

中、高劑量種籽黃酮灌胃小鼠后，小鼠肝、腎組織的M D A、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著低于模型組 （P＜0.05）。與模型組相比，中劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的MDA含量降低了23.75%、蛋白質(zhì)羰基含量降低了56.02%，高劑量種籽黃酮使小鼠肝組織的MDA含量降低了47.49%；中劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的MDA含量降低了75.89%、蛋白質(zhì)羰基含量降低了58.51%，高劑量種籽黃酮使小鼠腎組織的MDA、蛋白質(zhì)羰基含量分別降低了78.72%、80.50%。以上結(jié)果表明，肝、腎組織的MDA、蛋白質(zhì)羰基含量與種籽黃酮的灌胃劑量存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，黃酮?jiǎng)┝吭酱?，MDA、蛋白質(zhì)羰基含量越低。

與VC組相比，種籽黃酮中劑量組小鼠肝組織的CAT、GSH-Px活力均無(wú)顯著差異（P＞0.05），蛋白質(zhì)羰基含量顯著降低（P＜0.05），種籽黃酮高劑量組小鼠肝組織的MDA含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；種籽黃酮中劑量組小鼠腎組織的CAT活力、GSH-Px活力、蛋白質(zhì)羰基含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。這表明種籽黃酮具有較好的體內(nèi)抗氧化能力。

2.2 種籽黃酮成分分析結(jié)果

運(yùn)用分子特征提取技術(shù)獲取檢測(cè)到的化合物信息，得到分子質(zhì)量、分子式、一級(jí)質(zhì)譜信息及二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)裂解途徑，推測(cè)得到的化合物及結(jié)構(gòu)式如表3所示。

表 3 可供參考的黃酮類化合物信息Table 3 Available information on four flavonoids

化合物1：對(duì)質(zhì)荷比為m/z357的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行單離子提取，在保留時(shí)間為17.351 min檢出目標(biāo)離子。一級(jí)質(zhì)譜中給出m/z357為[M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜給出m/z219、165、137，結(jié)合文獻(xiàn)[22-24]推測(cè)其裂解途徑，m/z219為黃酮母核γ-吡喃酮環(huán)裂解發(fā)生RDA（Retro-Didls-Alder）重排產(chǎn)生的奇電子碎片離子[25-26]；m/z165是m/z219奇電子碎片離子上異戊基的芐基鍵斷裂產(chǎn)生的?鎓離子，同時(shí)丟失了一分子異丁烷基；m/z137是m/z165丟失一分子CO產(chǎn)生的奇電子碎片離子。推測(cè)此化合物可能為 2-(3,4-二羥基苯基)-5,7-二羥基-6-異戊基-4H-苯并吡喃-4-酮，裂解途徑如圖1所示。

圖 1 化合物1的裂解途徑Fig. 1 Cleavage pathway of compound 1

化合物2：對(duì)質(zhì)荷比為m/z381的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行單離子提取，在保留時(shí)間為15.280 min檢出目標(biāo)離子。一級(jí)質(zhì)譜中給出m/z381為[M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜給出m/z349、215、161，結(jié)合文獻(xiàn)[23]推測(cè)其裂解途徑，m/z349為 [M－CH3OH＋H]＋，由γ-吡喃酮環(huán)與甲氧基之間發(fā)生i鍵斷裂產(chǎn)生；質(zhì)荷比m/z349的γ-吡喃酮環(huán)裂解發(fā)生RDA重排反應(yīng)且芳香醚發(fā)生Cü O鍵斷裂，丟失—CH3產(chǎn)生m/z215；m/z161由m/z215丟失兩分子—CO產(chǎn)生。由此推測(cè)此化合物可能為2-(4-羥基苯基)-3,6-二甲氧基-8,8-二甲基-4H,8H-吡喃并[2,3-f]苯并吡喃-4酮，裂解途徑如圖2所示。

圖 2 化合物2的裂解途徑Fig. 2 Cleavage pathway of compound 2

化合物3：對(duì)質(zhì)荷比為m/z399的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行單離子提取，在保留時(shí)間為12.234 min檢出目標(biāo)離子。一級(jí)質(zhì)譜給出m/z399為[M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜給出m/z368、202、134，推測(cè)其裂解途徑，m/z368為[M－CH3OH＋H]＋，由γ-吡喃酮環(huán)與甲氧基之間發(fā)生i斷裂產(chǎn)生；m/z368的γ-吡喃酮環(huán)發(fā)生RDA重排反應(yīng)且失去一分子水產(chǎn)生m/z202；m/z134由m/z202發(fā)生芳香醚氫重排反應(yīng)，同時(shí)丟失一分子3-甲基-1,2-丁二烯產(chǎn)生。因此推測(cè)此化合物可能為5-羥基-2-(4-羥基-3-甲氧苯基)-3-甲氧基-7-((3-甲基-2-丁烯-1-基) 氧代)-4H-苯并吡喃-4-酮，裂解途徑如圖3所示。

圖 3 化合物3的裂解途徑Fig. 3 Cleavage pathway of compound 3

化合物4：對(duì)質(zhì)荷比為m/z461的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行單離子提取，在保留時(shí)間為14.892 min檢出目標(biāo)離子。一級(jí)質(zhì)譜給出m/z461為[M＋H]＋，二級(jí)質(zhì)譜給出m/z325、269、163。推測(cè)其裂解途徑，m/z325為[M－136＋H]＋，由黃酮母核B環(huán)芳香醚Cü O鍵斷裂和A環(huán)芳香醚Cü O鍵斷裂產(chǎn)生[12]；m/z269由m/z325丟失兩分子的—CO產(chǎn)生；m/z163為黃酮母核γ-吡喃酮環(huán)發(fā)生RDA重排反應(yīng)產(chǎn)生的奇電子碎片離子。推測(cè)此化合物可能為7-((4-甲氧芐基)氧代)-3-(2-甲氧苯基)-2-羧酸乙酯-4H-苯并吡喃-4-酮，其裂解途徑如圖4所示。

圖 4 化合物4的裂解途徑Fig. 4 Cleavage pathway of compound 4

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)皮下注射D-半乳糖構(gòu)建氧化損傷小鼠模型，評(píng)價(jià)西番蓮種籽黃酮的體內(nèi)抗氧化活性。與空白組相比，模型組小鼠肝、腎組織的T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著降低（P＜0.05），肝、腎組織的MDA、蛋白質(zhì)羰基含量均顯著升高（P＜0.05），表明氧化損傷模型建造成功。與模型組相比，各劑量組隨著黃酮灌胃劑量的增大，T-SOD和CAT、GSH-Px活力逐漸增大，MDA、蛋白質(zhì)羰基含量逐漸降低，灌胃劑量與抗氧化作用存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。與VC組相比，在提高CAT、GSH-Px活力，降低MDA、蛋白質(zhì)羰基含量方面，中、高劑量種籽黃酮的作用效果較好。

本實(shí)驗(yàn)采用LC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)西番蓮種籽黃酮成分進(jìn)行分析，通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)及已報(bào)道的文獻(xiàn)，對(duì)裂解方式進(jìn)行推測(cè)，目前可推測(cè)出4 種西番蓮種籽黃酮成分，分別為2-(3,4-二羥基苯基)-5,7-二羥基-6-異戊基-4H-苯 并吡喃-4-酮、2-(4-羥基苯基)-3,6-二甲氧基-8,8-二甲基-4H,8H-吡喃并[2,3-f]苯并吡喃-4酮、5-羥基-2-(4-羥基-3-甲 氧苯基)-3-甲氧基-7-((3-甲基-2-丁烯-1-基)氧代)-4H-苯 并吡喃-4-酮、7-((4-甲氧芐基)氧代)-3-(2-甲氧苯基) -2-羧酸乙酯-4H-苯并吡喃-4-酮。

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上具有酚羥基，可以作為供氫體發(fā)生自由基消除反應(yīng)，另外其鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可以螯合金屬離子，抑制脂質(zhì)氧化作用[27]。種籽黃酮通 過(guò)提高抗氧化酶活力、降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)抗氧化能力[28-29]，其抗氧化活性可能是這4 種黃酮成分共同作用的結(jié)果。已有的研究表明西番蓮果皮中的槲皮素[30]、葉片中的葒草素以及莖中的木樨草素與本研究中的化合物1具有相同的黃酮母核結(jié)構(gòu)，但它們之間的體外抗氧化活性關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

在軟電離條件下，黃酮類化合物母核質(zhì)譜裂解通常發(fā)生在C環(huán)上[24]，本研究中的4 種黃酮物質(zhì)均發(fā)生了RDA裂解，并列出了其各自的特征碎片離子，本研究結(jié)果豐富了紫果西番蓮全草的黃酮類別。LC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)提供多級(jí)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在化合物結(jié)構(gòu)鑒定中應(yīng)用廣泛，但該技術(shù)難以區(qū)分化合物的同分異構(gòu)體[24]，因此化合物結(jié)構(gòu)的確定還需要深入研究。