徐 瑩，茍 練，敬明武，葛宇龍，劉科亮，，徐培渝，

(1．四川大學華西公共衛(wèi)生學院/華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2．四川省疾病預防控制中心，四川 成都 610041)

乙烯利(ethephon，ETH)是植物生長調(diào)節(jié)劑中常用的一種，主要用于催熟果實。根據(jù)毒理學研究結(jié)果，小于2 mg/kg的乙烯利不會對機體造成損害。但近年來，由于其低劑量高效益的特點，導致其被普遍濫用。據(jù)文獻報道，高劑量乙烯利使雄性小鼠的精子活動率和精子計數(shù)明顯受到影響，使雌鼠子宮、卵巢質(zhì)量增加，子宮/體質(zhì)量比明顯高于對照組(蒸餾水)[1-2]。更有文章質(zhì)疑兒童出現(xiàn)性早熟的原因是攝入了過量施用了具有激素作用農(nóng)藥的果蔬[3-4]。性早熟指提前出現(xiàn)第二性征發(fā)育，導致兒童身材矮小，產(chǎn)生各種生理和心理問題。性發(fā)育由HPGA軸調(diào)控，青春期啟動時，Kisspeptin(KISS-1)或其受體(GPR54/KISS-1R)基因激活啟動HPGA軸，下丘腦大量釋放GnRH，GnRH與其垂體上受體GnRHR結(jié)合后，刺激垂體分泌黃體生成素(lutenizing hormone，LH)和促卵泡生成素(folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH)，作用于各生殖器官使其增重發(fā)育，使相應器官分泌雌雄激素，從而影響青春期性發(fā)育。至今，關(guān)于乙烯利促進兒童性早熟的研究尚少，其是否通過影響HPGA軸發(fā)揮作用也待進一步研究證實。因此，本研究以青春期前SD雌鼠為模型探討乙烯利對性早熟的影響以及相關(guān)的分子機制，以期為全面評價乙烯利的安全性提供預防措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物乙烯利原藥50 g，瓶裝，純度≥90%，CAS號16672-87-0。由索萊寶公司生產(chǎn)，購于四川省豪乙生化公司，其性狀為灰白色蠟狀固體。用蒸餾水配制溶液，冷藏儲存。

1.1.2 試劑異丙醇，購自四川豪乙生物有限公司；大鼠黃體生成素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(Rat lutenizing hormone ELISA Kit， 批 號 CSB-E12654r)、大鼠促卵泡生成素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(Rat follicle-stimulating hormone ELISA Kit，批號 CSBE06869r)購于索萊寶生物有限公司。所有引物均由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組處理第一批SPF級SD雌性孕鼠自行產(chǎn)子，由親鼠自養(yǎng)，仔鼠出生15日齡(postnatal day 15，PND 15)時，根據(jù)動物的體質(zhì)量，按窩別隨機分為4組，乙烯利低、中、高劑量組(134、269、538 mg/kg)和陰性對照組(給予同體積蒸餾水)。陰性對照組10只，低劑量組11只，中高劑量組每組各12只。自PND 15時開始經(jīng)口灌胃染毒每天1次、連續(xù)5 d，至PND 21時，斷乳。染毒期間每日檢查陰道是否開口，上、下午各一次，記錄陰道開口時間。幼鼠在末次染毒48 h后，麻醉處置；第二批SPF級SD雌性孕鼠自行產(chǎn)子，PND 15時按上述方法分組，每組仔鼠為9只，開始經(jīng)口灌胃染毒每天1次、連續(xù)5 d，至PND 21時，斷乳。處死小鼠，腹主動脈采血2 mL，2 h后分離出血清保存于-80℃冰箱以檢測血清中FSH和LH水平；取下丘腦和垂體組織存于-80℃冰箱。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中LH、FSH激素水平獲得的血清參照LH和FSH ELISA試劑盒說明書進行二者表達水平的測定，采用酶標儀于450 nm波長處，讀取吸光度D(450)值。根據(jù)D(450)值繪制標準曲線，計算樣本濃度。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測GPR54、KISS-1、GnRH、GnRHRmRNA表達水平用PureLink RNA Mini Kit試劑盒要求提取垂體和下丘腦中總RNA，UV紫外分光光度計于260 nm波長處檢測RNA吸光度，得其濃度；利用羅氏第一鏈cDNA合成試劑盒，每組取1μg總RNA進行cDNA逆轉(zhuǎn)。然后利用2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR GreenⅠ)進行cDNA擴增。PCR反應條件：95℃、1 min；95℃、10 s，60℃、10～15 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCT值(ΔCT=CT，目的基因-CT，β-actin；ΔΔCT=ΔCT，實驗組-ΔCT，對照組)表示目的基因mRNA相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)先進行方差齊性檢驗，若方差齊，進行方差分析，如P＜0.05，用LSD法進行兩兩比較；若方差不齊，轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)后，再進行方差齊性檢驗；若仍不齊，用秩和檢驗，如P＜0.05，用Dunnett’s T3法進行兩兩比較。應用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 乙烯利對青春期前SD雌性大鼠急性經(jīng)口毒性研究

在進行乙烯利對SD雌性大鼠性發(fā)育影響的探究之前，本實驗進行了乙烯利對青春期前SD雌性大鼠的經(jīng)口急性毒性試驗。根據(jù)實驗結(jié)果查表得知，LD50值為4 300 mg/kg，95%置信區(qū)間為2 950～6 260 mg/kg。根據(jù)急性(LD50)劑量分級評價標準，屬于低毒級。后續(xù)實驗的受試物劑量設(shè)置即根據(jù)LD50的值。

2.2 乙烯利對青春期前SD雌鼠陰道開口時間的影響

如圖1結(jié)果所示，乙烯利中劑量組青春期前SD雌鼠陰道開口時間早于陰性對照組，乙烯利高劑量組陰道開口起始時間明顯晚于對照組，且差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖1 乙烯利各處理組中大鼠陰道開口時間

2.3 乙烯利對SD雌鼠血清性激素水平變化的影響

如表2所示，乙烯利高劑量組的FSH濃度與陰性對照組相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，乙烯利中、低劑量組的FSH濃度與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；乙烯利低、中、高劑量組的LH濃度與陰性對照比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 乙烯利各處理中青春期前SD雌鼠血清激素水平(x±s)

2.4 乙烯利對HPGA軸相關(guān)基因的影響

下丘腦組織HPGA軸相關(guān)基因mRNA的表達情況如圖2所示，對GPR54、KISS-1、GnRH基因，在乙烯利中劑量組的mRNA表達水平均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學的意義(P＜0.05)，乙烯利低、高劑量組的表達水平與對照相比，差異無統(tǒng)計學意義。垂體組織中，乙烯利各劑量組組中GnRHR mRNA表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖2 乙烯利各處理中青春期前SD雌鼠下丘腦和垂體組織中HPGA軸相關(guān)基因的mRNA表達水平

3 討論

生殖發(fā)育毒性指受試物對人體生殖器官、內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生了有害影響以及不良妊娠結(jié)局的出現(xiàn)。陰道開口與第一次排卵的時間，是判斷雌鼠青春期起始兩個決定性指標[5]。本實驗中，乙烯利中劑量組促進青春期前SD雌性大鼠陰道開口時間提前，高劑量組使其延后，且差異均較對照組具有統(tǒng)計學意義，本實驗結(jié)果再一次明確了一定劑量的乙烯利能導致青春期前SD雌性大鼠性早熟。PND 29時，陰性對照組大鼠陰道陸續(xù)開口，PND 25/26時，低、中劑量組大鼠陰道陸續(xù)開口，而高劑量組第1只大鼠陰道開始時間是PND 32，比陰性對照組晚了3天。本實驗劑量設(shè)計參考急性毒性試驗結(jié)果，高劑量組出現(xiàn)陰道開口時間推遲，可能與高劑量組大鼠體質(zhì)量降低(結(jié)果未展示)等毒性反應有關(guān)，同時激素具有正向促進和反向抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，因此，在高劑量下陰道開口時間較陰性對照組推遲的另一原因可能是在高劑量下，激素水平已高達一定程度進而對青春期性發(fā)育調(diào)控起抑制作用。

促性腺激素廣泛存在于血清中，主要作用是促進子宮、卵巢和睪丸等生殖器官的生長和發(fā)育，并刺激生殖器官分泌雌激素和雄激素，進一步促進子宮、輸卵管、陰道及外生殖器的生長發(fā)育。因此血清中性激素(LH和FSH)濃度也常被作為評價性發(fā)育的指標。本實驗中，各處理組血清中LH、FSH濃度與對照組相比并無明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織中，弓狀核及腦室前腹側(cè)區(qū)的KISS-1基因編碼Kisspeptin。GPR54是Kisspeptins的特異性受體，大量存在于下丘腦，Kisspeptins與GPR54結(jié)合，激活GnRH神經(jīng)元，并大量分泌GnRH[6-8]。后者被認為是青春期啟動的分子閥門[9]。下丘腦釋放的GnRH與其在垂體的受體(GnRHR)結(jié)合后，促進垂體合成分泌促性腺激素(LH和FSH)?；诖耍覀冊谵D(zhuǎn)錄水平進一步探究了乙烯利對KISS-1/GPR54/GnRH/GnRHR表達的影響。在本實驗結(jié)果中，乙烯利中劑量組中KISS-1/GPR54/GnRH mRNA表達水平均高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，因此可以提示FSH和LH在實驗觀察期間可能發(fā)生了變化。然而，本實驗中并未觀察到FSH和LH改變可能是由于血清性激素水平呈動態(tài)變化，而在本實驗時間點條件下，未見乙烯利對青春期前SD雌鼠血清激素水平產(chǎn)生明顯影響。因此，根據(jù)本實驗結(jié)果暫不能認為乙烯利對血清中性激素水平產(chǎn)生了影響。

綜上，我們的實驗結(jié)果明確了一定劑量的乙烯利會促進青春期前SD雌性大鼠性早熟。其作用的機制可能與上調(diào)KISS-1/GPR54/GnRH/GnRHR信號通路的表達有關(guān)。由于本實驗取材時間點設(shè)計不夠完整，因此未能觀察到激素水平的變化。建議后續(xù)實驗增加各組處理動物的數(shù)量，以增加采血的時間點，多時間點測血清激素，以使實驗數(shù)據(jù)更完善。