賈藝悅，牟感恩，孟 鑫，沈 秀，周則衛(wèi)，龍 偉

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192)

由于新藥研發(fā)成本高，失敗率高，周期長[1]，近年來老藥新用作為藥物開發(fā)策略越來越受到重視[2]，并由此誕生了大量的新適應(yīng)癥藥物。雙硫侖(disulfiram，DSF)，分子式為C10H20N2S4，化學(xué)名為二硫化四乙基秋蘭姆，又稱戒酒硫、酒畏等，商品名為安塔布司(Antabuse)，是一種較有前途的抗癌藥物。早先發(fā)現(xiàn)DSF可以用于治療酒精依賴，抑制酒精代謝過程中的乙醛脫氫酶，導(dǎo)致毒性物質(zhì)乙醛在人體內(nèi)大量累積，引起機(jī)體多種不適，達(dá)到戒酒目的[3]；并且具有良好的安全性和耐受性[4]。在過去30年中，有報道DSF對多種腫瘤細(xì)胞株具有良好的體外抗腫瘤活力性[5-8]，如乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌和前列腺癌等。DSF抑制泛素蛋白酶體/核轉(zhuǎn)錄因子NFκB通路、多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)、拓?fù)洚悩?gòu)酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、核蛋白定位因子NPL4，調(diào)控MAP激酶通路。它能根除腫瘤干細(xì)胞(CSCs)，顯著逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性[9-13]。有研究報道，DSF的抗腫瘤機(jī)制為：在血清中迅速被還原為DDC，DDC是一種很強(qiáng)的過渡二價金屬離子螯合劑，可結(jié)合銅離子。DSF接觸銅離子的瞬間可觸發(fā)活性氧產(chǎn)生，損傷DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡；而DDC與銅離子螯合形成的最終復(fù)合物會產(chǎn)生更強(qiáng)更持久的殺傷作用[14]，DSF在血清中的轉(zhuǎn)化過程見圖1。DDC的硫醇基團(tuán)是活性基團(tuán)，秋蘭姆結(jié)構(gòu)及氮原子對其發(fā)揮活性是必不可少的[15]。在此基礎(chǔ)上，我們對DSF結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，保留中間四個硫的活性部位，將兩邊換為對稱的哌嗪基團(tuán)，哌嗪基團(tuán)比DSF多1個叔胺的堿性基團(tuán)，會有一定線粒體靶向性。故此期望得到有更好抗腫瘤活性的衍生物。

圖1 DSF在血清中的轉(zhuǎn)化及活性形式

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器和RE-5299循環(huán)式真空水泵，購自鞏義予華儀器責(zé)任有限責(zé)任公司；BuChiR-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自瑞士BuChi公司；DZF-6020真空干燥箱，購自上海精宏儀器有限公司；紫外分光光度計，購自上海光譜儀器有限公司；GF254薄層層析硅膠板，購自煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；核磁共振波譜儀，購自德國Bruker公司；多色熒光化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，購自德國Alliance公司。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肺癌細(xì)胞A549，均由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所提供。流式分析儀，購自美國BDbioscience公司。DSF(純度＞99%)、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自大連美侖生物公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自以色列BI公司；磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-碘化吡啶Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自凱基生物有限公司；PARP抗體和BAX抗體，購自美國Proteintech公司。

1.2 DSF衍生物的合成

胺、二硫化碳在KOH、NaOH或NaH等強(qiáng)堿存在下反應(yīng)，在適當(dāng)?shù)娜軇┲?常用乙醇作溶劑)形成對應(yīng)的氨基二硫代甲酸鹽，然后，再用碘單質(zhì)將其氧化可得目標(biāo)化合物。

衍生物DSF-1的合成步驟如下：取2 mL甲基哌嗪，溶于少許乙醇，加入溶有0.72 g NaOH的1 mL的水溶液，冰水浴下緩慢滴加1.1 mL二硫化碳，溶液起初為淡綠色，很快變?yōu)橥咙S色。室溫攪拌約6 h，體系為棕黃色。分次加入2.3 g碘單質(zhì)的2 mL的乙醇溶液，很快有白色沉淀析出，反應(yīng)4 h體系為淡黃色，最后得到白色粉末2.085 g，產(chǎn)率33.04%。合成路線見圖2。薄層層析(二氯甲烷∶甲醇=8∶1)顯示為1個點。純化后通過質(zhì)譜和核磁氫譜、碳譜確證化合物的結(jié)構(gòu)，為雙(4-甲基-1-1-哌嗪基硫代甲酰基)二硫。

圖2 DSF-1的合成路線

衍生物DSF-2的合成步驟如下：取2 mL乙基哌嗪，溶于少許乙醇，加入含有0.63 g NaOH的1 mL的水溶液，冰水浴下緩慢滴加0.95 mL二硫化碳，溶液起初為淡綠色，很快變?yōu)榈S色。室溫攪拌約6 h，體系為棕黃色。分次加入2.0 g碘單質(zhì)的2 mL的乙醇溶液，很快有大量白色物質(zhì)析出，反應(yīng)4 h后體系變?yōu)榈S色，最終得到白色粉末1.504 g，產(chǎn)率25.24%，合成路線見圖3。薄層層析(二氯甲烷∶甲醇=8∶1)為1個點，純化后通過質(zhì)譜和核磁氫譜、碳譜確證化合物的結(jié)構(gòu)，為雙(4-乙基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

圖3 DSF-2的合成路線

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7和A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、相對濕度95%。細(xì)胞生長覆蓋95%皿底面積時傳代。

1.4 細(xì)胞增殖情況檢測

受試物用DMSO溶解后，用DMEM培養(yǎng)基將其稀釋為50、10、5、1和0.5μmol/L的溶液；含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋為10、5、1、0.5、0.1 μmol/L的溶液。NAC用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解，濃度為1 mmol/L。

細(xì)胞處于對數(shù)生長期時胰酶消化，用細(xì)胞計數(shù)板計算細(xì)胞密度，按每孔5 000個細(xì)胞種于3個96孔板中，孵育24 h。待細(xì)胞貼壁并穩(wěn)定生長后棄去舊培養(yǎng)液，第1個96孔板加入含10%FBS的DMEM配置的不同濃度的受試物溶液100μL，空白孔加入10%FBS的DMEM。第2個96孔板先加入含10%FBS的DMEM配置的不同濃度的受試物溶液50μL，每個孔再加入配好的NAC溶液50μL混勻，空白孔為10%FBS的DMEM和NAC溶液的混合液。第3個96孔板加入DMEM配置的不同濃度的溶液100μL，空白組為DMEM。每個濃度均設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CCK-8溶液，37℃避光孵育，經(jīng)酶標(biāo)儀在480 nm處檢測吸光度值，利用Graphpad軟件計算IC50值，繪制存活率圖，并進(jìn)行t檢驗。細(xì)胞存活率為試驗孔吸光度值與對照孔吸光度值的比值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

受試物均用DMSO溶解，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將DSF稀釋為50、30μmol/L的溶液，將DSF-1和DSF-2稀釋為20、10μmol/L的溶液。NAC用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解，濃度為1 mmol/L。對數(shù)生長期的A549細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞進(jìn)行消化離心計數(shù)，6孔板每孔鋪20萬個細(xì)胞，孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，按加入化合物的不同，以及是否含NAC，將MCF-7和A549細(xì)胞分為6個處理組，見表1。

表1 MCF-7和A549細(xì)胞的分組

作用24 h后收集死亡細(xì)胞，其余細(xì)胞用PBS沖洗并用胰酶消化收集并離心。將離心后的細(xì)胞重新懸浮在500μL緩沖液中，依次加入5μL FITC和5μL PI避光反應(yīng)15 min。然后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。用BD Accuri C6軟件進(jìn)行分析，直接可得細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞和MCF-7的細(xì)胞消化離心計數(shù)，六孔板每孔鋪20萬個細(xì)胞，孵育24 h。棄去培養(yǎng)基。受試物用DMSO溶解后，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋。MCF-7細(xì)胞各孔分別加入30 μmol/L的DSF溶液，10μmol/L的DSF-1溶液，10 μmol/L的DSF-2溶液，均為2 mL；A549細(xì)胞各孔分別加入50μmol/L的DSF溶液，20μmol/L的DSF-1溶液，20μmol/L的DSF-2溶液，均為2 mL。

作用24 h，收集細(xì)胞，常規(guī)裂解制備蛋白樣品，經(jīng)BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。每組各取40μg總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE，隨后將蛋白印跡轉(zhuǎn)到PVDF膜上，經(jīng) 5%脫脂奶粉封閉、相應(yīng)一抗溶液(1∶1 000稀釋)4℃孵育，以及合適的二抗溶液(1∶3 000稀釋)孵育。最后采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑孵育曝光，相關(guān)結(jié)果采用多色熒光化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照，Image J分析條帶灰度值。

蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均3次重復(fù)，用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及t檢驗，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 衍生物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 DSF-1 白色固體，m.p.143.6～144.8℃；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：2.38(s,6H,CH3),2.61[t,8H,N(CH2)2],4.34[t,8H,CSN(CH2)2]；13C NMR(CDCl3)δ： 193.55(CS2),54.53(NCCN),45.61(CH3)； LC-MS m/z： 351.081(M+)。為雙(4-甲基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

2.1.2 DSF-2 白色固體，m.p.118.6～119.6℃；1H NMR(CDCl3，400 MHz) δ：4.34[t,8H,SCN(CH2)2],2.65[t,8H,N(CH2)2],2.5(q,J=7.2HZ,4H),1.15(t,J=7.2HZ,6H,CH3)；13C NMR(CDCl3)δ：193.35(CS2),51.84(CH2),52.3(NCCN),12.00(CH3)；LC-MS m/z：379.110(M+)。為雙(4-乙基-1-1-哌嗪基硫代甲?；?二硫。

2.2 CCK-8實驗結(jié)果

用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配制DSF及其2個衍生物，作用于MCF-7和A549細(xì)胞，CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見表2?？梢娮饔脮r間在48 h時，兩個衍生物對兩種腫瘤細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于DSF，IC50的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 DSF和衍生物分別作用于兩種腫瘤細(xì)胞48 h時的IC50

DSF及其2個衍生物在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細(xì)胞的增殖抑制作用見圖4～圖6?？梢婓w系中含F(xiàn)BS時，DSF及其2個衍生物作用下的MCF-7和A549細(xì)胞存活率均較不含F(xiàn)BS時降低，這一結(jié)果也與其他文獻(xiàn)的報道一致[17]。可能的原因是因FBS中有銅離子，DSF及其衍生物抑制這兩種腫瘤細(xì)胞的增殖需要銅離子的存在。

此外，NAC可以抑制ROS的產(chǎn)生，DSF及其2個衍生物在含與不含NAC兩種條件下對MCF-7和A549細(xì)胞的增殖抑制作用見圖7～圖9?？梢婓w系中含NAC時，DSF及其2個衍生物作用下的MCF-7和A549細(xì)胞存活率均較不含NAC時升高(P＜0.05或P＜0.01)，提示DSF及其2個衍生物可能是通過產(chǎn)生ROS發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

圖4 DSF在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細(xì)胞的增殖抑制作用

圖5 DSF-1在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細(xì)胞的增殖抑制作用

圖6 DSF-2在含與不含F(xiàn)BS兩種條件下對MCF-7和A549細(xì)胞的增殖抑制作用

圖7 DSF在含與不含NAC兩種條件下對兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

圖8 DSF-1在含與不含NAC兩種條件下對兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

圖9 DSF-2在含與不含NAC兩種條件下對兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

2.3 細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖10，可見與DSF相比，DSF-1和DSF-2作用后的MCF-7和A549細(xì)胞凋亡比例均增加(P＜0.05或P＜0.01)；與不加NAC相比，DSF-1和DSF-2加入NAC作用后的MCF-7和A549細(xì)胞凋亡比例減少(P＜0.05或P＜0.01)。

圖10 DSF及其2種衍生物對MCF-7和A549細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Western blot實驗結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果見圖11和圖12，可見與對照組比較，DSF-1和DSF-2作用后MCF-7和A549細(xì)胞的PARP表達(dá)水平降低(P＜0.05或P＜0.01)，DSF及其2種衍生物作用后MCF-7和A549細(xì)胞的BAX表達(dá)水平升高(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

雙硫侖發(fā)揮抗腫瘤作用主要是依賴于秋蘭姆結(jié)構(gòu)及氮原子[15]。我們在前期大量的結(jié)構(gòu)改造衍生物中篩選出了哌嗪環(huán)連接簡單基團(tuán)這一結(jié)構(gòu)特征的衍生物，衍生物1和衍生物2活性較為突出。

雙硫侖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，可以增加黑色素瘤細(xì)胞的ROS水平，其活性能夠被外源性的抗氧化劑抑制[5]。Colin等發(fā)現(xiàn)雙硫侖對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-BE及人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤UVW的抑制作用在有血清時呈雙相作用，在低濃度時加入銅離子螯合劑時DSF失去活性，表明DSF/Cu復(fù)合物發(fā)揮抗腫瘤作用；在高濃度時加入NAC，DSF失去活性，表明氧化應(yīng)激占主導(dǎo)[17]。而在本實驗選擇的兩種腫瘤細(xì)胞中DSF及兩個衍生物的抑制作用呈劑量依賴，并且在不加血清時完全失去活性。血清中有15μmol/L銅離子，10%～15%的血清中有1.5～2.3μmol/L銅離子[16]，因此衍生物發(fā)揮抗腫瘤作用需要血清中的銅離子。同時我們也觀察到在兩種腫瘤細(xì)胞中，抗氧化劑會明顯抑制衍生物的活性，證明其通過產(chǎn)生ROS發(fā)揮抗腫瘤作用。流式細(xì)胞術(shù)證明了DSF及兩個衍生物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且這種作用可以被NAC抑制。

圖11 DSF及其2種衍生物對MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖12 DSF及其2種衍生物對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡分為3種途徑：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，死亡受體途徑和線粒體途徑。研究報道雙硫侖通過調(diào)節(jié)線粒體通路相關(guān)蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。BCL-2家族蛋白中促凋亡與促存活蛋白之間的相互作用控制著細(xì)胞色素C等物質(zhì)從線粒體釋放。其中BAX是研究最廣泛的促凋亡蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號誘導(dǎo)時，BAX構(gòu)象改變向線粒體轉(zhuǎn)位并形成二聚體，PT孔打開，細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)蛋白水解及caspase激活[18]。多聚ADP核糖聚合酶(PARP)是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，在維持基因組的完整性方面起著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞凋亡過程中，激活的caspase-3將PARP酶剪切為89 kD和24 kD兩個片段，使其失去PARP原酶的正常功能。Western blot實驗結(jié)果表明衍生物可以增加兩種腫瘤細(xì)胞中BAX的表達(dá)，減少PARP酶的表達(dá)。但具體的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。同時，還需要進(jìn)一步的體內(nèi)荷瘤實驗確證衍生物的抗腫瘤活性。

綜上所述，合成的兩個雙硫侖衍生物具有一定的體外抗腫瘤功效，優(yōu)于雙硫侖，且其活性與銅離子的存在密切相關(guān)。其機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生相關(guān)。