藍(lán)丹純 廖榮臻 李知行 張弘弢 李子勇

(1佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院；3深圳市中醫(yī)院；4廣東省中醫(yī)院)

全世界大約11個(gè)成年人中有1個(gè)患有糖尿病，而90%為2型糖尿病(T2DM)。亞洲是迅速出現(xiàn)的全球T2DM流行主要地區(qū)，而中國(guó)和印度是其中的兩大重災(zāi)區(qū)。心腦血管并發(fā)癥是這些患者發(fā)病率和死亡率的主要原因〔1〕。胰島素抵抗(IR)是高血壓、冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔2〕，大量基礎(chǔ)研究亦表明血管內(nèi)皮的IR在心腦血管疾病的進(jìn)展中起著重要作用，并與炎癥反應(yīng)之間相互影響、相互促進(jìn)〔3，4〕。針灸作為古老的治療手法，不論是改善IR，還是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，其良好的治療作用均已經(jīng)得到臨床驗(yàn)證〔5，6〕。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)IR大鼠模型，以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，觀察針刺干預(yù)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核因子(NF)-κB p65蛋白及其磷酸化水平的影響，并進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)與IR相互作用及治療效應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物選用廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性SPF級(jí)SD(Sprague Dawley)大鼠24只，使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0001。并于該中心SPF級(jí)環(huán)境內(nèi)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。高脂飼 料配方(D12492，質(zhì)量比)：蛋白26.2%，碳水化合物26.3%，脂肪34.9%(購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；普通飼料配方(質(zhì)量比)：豆粕21%，稻谷4%，玉米31%，小麥18%，黃豆2%，魚粉6%，預(yù)混料3.5%，麩皮10%，蛋黃粉3%，植物油1.5%，多種維生素1%(購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用的倫理指導(dǎo)原則下進(jìn)行。

1.2主要試劑及儀器 腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒均購(gòu)eBioscience公司；空腹胰島素(FINS)測(cè)定試劑盒購(gòu)自默科迪亞公司；NF-κB p65 及p-NF-κB p65抗體試劑盒購(gòu)自美國(guó)CST公司；胰島素注射液(諾和靈R，EVG3439)；TEM-1200EX型透射電鏡；G6805-2A型低頻電子脈沖治療儀(YZB/滬0735-26-2009)；血糖儀(羅氏血糖儀)；微量注射泵：(YZB/粵0641-2008)；針灸針(華佗牌，規(guī)格：0.35 mm×13 mm)。

1.3穴位定位 本實(shí)驗(yàn)所選的穴位定位〔7〕：①腎俞：大鼠后背部第二腰椎下旁開0.5 cm處；②足三里：大鼠后肢膝關(guān)節(jié)外下方，即腓骨小頭下約0.5 cm處；③三陰交：大鼠后肢內(nèi)踝尖直上1 cm處；④內(nèi)關(guān)：前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約0.3 cm的尺橈骨縫間。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 將24只SD大鼠隨機(jī)地平均分配至空白組、模型組及電針組各8只?？瞻捉M大鼠喂以普通飼料12 w；模型組及電針組大鼠喂以D12492高脂飼料12 w以誘導(dǎo)IR模型。予以電針組大鼠針刺干預(yù)，同側(cè)的足三里及三陰交給予疏密波(疏波2 Hz，密波50 Hz，調(diào)制頻率10次/min)的電流刺激，刺激強(qiáng)度以局部肢體輕微抖動(dòng)為度，20 min/次，1次/d，持續(xù)治療28 d。

1.5標(biāo)本采集及檢測(cè)

1.5.1高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)〔8〕待全部大鼠禁食不禁水8 h后，將充分麻醉的大鼠固定于鼠板上，鈍性分離大鼠的左側(cè)頸總動(dòng)脈及右側(cè)頸外靜脈，而后分別于其中插送深約2.5 cm的PE管(PE管中已預(yù)先注入80 U/ml的肝素生理鹽水溶液)，并將PE管穩(wěn)固于肩胛部皮下；右側(cè)頸靜脈PE導(dǎo)管末端連接三通旋塞，接通微量泵端口，分別輸注胰島素及葡萄糖。首次0 min經(jīng)頸動(dòng)脈取血采樣，檢測(cè)基礎(chǔ)胰島素和基礎(chǔ)血糖(BBG)，而后以速率為0.12 U/(kg·h)恒速輸入0.05 U/ml的胰島素溶液。每隔5 min測(cè)一次大鼠的空腹血糖(FPG)值，當(dāng)FPG值超過(guò)(BBG±0.5)mmol/L范圍時(shí)，可泵注20%的葡萄糖溶液，并且每隔10 min采血檢測(cè)FPG，而后根據(jù)波動(dòng)的血糖值調(diào)整糖的泵注速率，使FPG值穩(wěn)定維持在(BBG±0.05)mmol/L上下。等達(dá)到機(jī)體穩(wěn)態(tài)后，則每5 min采血測(cè)定FPG，取穩(wěn)態(tài)下6次葡萄糖輸注速率(GIR)的平均值作為GIR，GIR=穩(wěn)態(tài)時(shí)GIR×葡萄糖濃度×1 000/體重(kg)/60；取穩(wěn)態(tài)下6次FPG的平均值作為穩(wěn)態(tài)下的FPG。

1.5.2檢測(cè)方法 整個(gè)治療療程結(jié)束后，禁食不禁水12 h，次晨于麻醉后眼眶靜脈竇采血。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定FPG；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定FINS，所有步驟按說(shuō)明書嚴(yán)格操作；采用液相芯片技術(shù)(Luminex/2000)測(cè)定TNF-α、IL-6水平。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，截取大小約3 mm×2 mm的主動(dòng)脈置于2.5%戊二醛溶液中固定，備透視電鏡觀察，余下的主動(dòng)脈置于凍存管并于-20℃下保存，用于Western印跡檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，方差齊性用LSD比較，方差不齊用Tamhane比較。

2 結(jié) 果

2.1針刺前后IR模型大鼠血清FPG、FINS、GIR的變化 針刺前，模型組GIR、FPG及FINS較電針組無(wú)明顯差異(P>0.05)，與空白組比較，其余兩組GIR水平顯著降低，F(xiàn)PG及FINS水平顯著升高(P<0.01)。針刺后，模型組、電針組大鼠血清FPG、FINS水平較空白組顯著升高(P<0.01)，GIR水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)；電針組大鼠血清FPG、FINS水平較模型組顯著降低，GIR水平明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 針刺前后各組FPG、FINS及GIR的比較

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

2.2電針對(duì)IR模型大鼠血清TNF-α及IL-6的影響 模型組大鼠的血清TNF-α、IL-6較空白組明顯升高(P<0.01)。電針組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較模型組明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清TNF-α及IL-6比較

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.3電針對(duì)IR模型血管NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 模型組、電針組血管內(nèi)皮的磷酸化(p)-NF-κB p65水平及蛋白表達(dá)較空白組顯著升高(P<0.01)，電針組血管內(nèi)皮p-NF-κB p65水平及蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表3、圖1。

2.4電針對(duì)IR模型大鼠血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)的影響 在透視電鏡下可見(jiàn)，空白組大鼠主動(dòng)脈的內(nèi)皮層完整連續(xù)平滑，緊貼于動(dòng)脈壁內(nèi)層，細(xì)胞下間隙連接緊密，線粒體形態(tài)無(wú)明顯異常；模型組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞下層疏散，扁平細(xì)胞與動(dòng)脈壁間隙增寬，線粒體形態(tài)異常，壁上出現(xiàn)多量的空泡樣線粒體；電針組中大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞與壁間隙稍增寬，部分線粒體形態(tài)改變，嵴部局部消失。見(jiàn)圖2。

表3 各組血管 內(nèi)皮NF-κB p65蛋白表達(dá)的比較

圖1 各組主動(dòng)脈NF-κB p65 Western印跡比較

a內(nèi)皮細(xì)胞；b 壁下間隙；c 線粒體 圖2 各組血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)(×15 000)

3 討 論

T2DM的主要誘因是過(guò)多高熱量飲食攝入而導(dǎo)致的肥胖。其引起的機(jī)體過(guò)多脂肪堆積會(huì)使得機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，慢性炎癥是IR的主要原因之一〔9〕。而血管IR的表現(xiàn)為因胰島素引起的血管舒張異常而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙〔10〕。內(nèi)皮功能障礙是血管疾病的初始階段，是心血管和代謝疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓或糖尿病)的強(qiáng)有力預(yù)測(cè)因子〔11，12〕。同時(shí)內(nèi)皮功能障礙也是T2DM自然史上最早發(fā)現(xiàn)的功能紊亂。此與機(jī)體長(zhǎng)期高水平的血糖濃度及炎癥狀態(tài)密不可分〔13〕。當(dāng)IR加速著T2DM疾病進(jìn)展的同時(shí)，心腦血管疾病也在血管功能障礙誘發(fā)下逐漸地顯現(xiàn)出來(lái)〔14，15〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明電針可提高外周胰島素敏感性。NF-κB是炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，表達(dá)促炎細(xì)胞因子，如IL-1β和IL-6，通常以p50和p65亞基及抑制蛋白κB抑制因子(IκB)α組成的無(wú)活性復(fù)合物形式存在。其中，NF-κB p65具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性及DNA結(jié)合親和力〔16〕。在細(xì)胞溶質(zhì)中，NF-κB與IκBα相關(guān)，后者控制著NF-κB的核易位。IκBα的降解導(dǎo)致NF-κB激活，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來(lái)，NF-κB的磷酸化，特別是NF-κB p65的磷酸化已成為轉(zhuǎn)錄激活的新機(jī)制〔17〕。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂肪堆積狀態(tài)能激活機(jī)體中的NF-κB，而抑制NF-κB通路可以減輕高脂肪飲食引起的肥胖〔18〕。

一方面，機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)直接改變胰島素靶器官血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)，破壞了機(jī)體的保護(hù)屏障。此外，脂毒性或者炎癥狀態(tài)觸發(fā)著內(nèi)皮功能障礙，從而誘發(fā)內(nèi)皮層的病理改變。另一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體的數(shù)量或形態(tài)的改變，都將影響線粒體呼吸鏈的功能，阻礙機(jī)體的糖脂代謝，最終誘發(fā)糖脂毒性〔19〕。而增加的活性氧激活了NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)一步增加炎性因子的表達(dá)，從而又使內(nèi)皮損傷及IR進(jìn)一步惡化〔20〕。

本研究所選的4個(gè)穴位，具有補(bǔ)益腎脾之功，可有效降低大鼠空腹血糖及空腹胰島素水平，增強(qiáng)靶器官胰島素敏感性，逆轉(zhuǎn)IR現(xiàn)象，再次驗(yàn)證了既往的研究結(jié)果。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞層在經(jīng)過(guò)電針的干預(yù)治療后，動(dòng)脈內(nèi)皮層病理狀態(tài)得到了改善，此與NF-κB信號(hào)通路調(diào)控慢性炎癥密不可分。