范琳媛，李紅凌

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 婦科，北京 100026；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 組織工程中心，北京 100005)

骨骼具有機(jī)械支持、肌肉附著、儲(chǔ)存鈣磷等礦物質(zhì)功能，這些功能的維持需要骨組織處于骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，即維持骨穩(wěn)態(tài)(bone homeostasis)。當(dāng)骨形成與骨吸收之間代謝平衡失調(diào)，單位結(jié)構(gòu)內(nèi)骨量下降，骨質(zhì)疏松癥等骨代謝相關(guān)疾病發(fā)生。近年來，隨著對(duì)長鏈非編碼RNAs(long noncod-ing RNAs,lncRNAs)功能的認(rèn)識(shí)，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs不僅可以順式調(diào)節(jié)臨近基因轉(zhuǎn)錄，還能遠(yuǎn)距離影響靶基因的表達(dá)，在骨基質(zhì)合成、骨吸收和骨修復(fù)等過程發(fā)揮作用。本文就參與骨形成和骨吸收過程的lncRNAs及其調(diào)控機(jī)制展開綜述。

1 長鏈非編碼RNAs生物學(xué)特征

lncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，幾乎不具有編碼蛋白功能。哺乳動(dòng)物中4%～9%基因組序列轉(zhuǎn)錄成lncRNAs，而只有不到2%基因組轉(zhuǎn)錄為編碼基因mRNAs。根據(jù)lncRNAs在基因組中與鄰近基因位置關(guān)系，lncRNAs一般分為順式lncRNAs(sense)、反式lncRNAs(antisense)、雙向lncRNAs(bidirectional)、內(nèi)含子lncRNAs(intronic)、基因間lncRNAs(intergenic)[1]。lncRNAs一般具有polyA、具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)和特定的細(xì)胞定位，在不同的分化過程具有動(dòng)態(tài)表達(dá)，lncRNAs在不同組織中的表達(dá)量不同，相同的組織在不同的狀態(tài)時(shí)表達(dá)量也不同。LncRNAs功能多樣，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，可以在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多水平進(jìn)行基因調(diào)控。隨著基因組學(xué)的進(jìn)步，越來越多的報(bào)道lncRNAs在調(diào)節(jié)核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，生命發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[2]。

2 骨穩(wěn)態(tài)維持

正常生理狀態(tài)下，骨形成和骨吸收處于一種動(dòng)態(tài)平衡，骨組織保持一種骨穩(wěn)態(tài)。隨著年齡增加或女性絕經(jīng)等因素，骨吸收高于骨形成，骨生成和骨吸收平衡被打破，導(dǎo)致骨密度降低，骨質(zhì)出現(xiàn)疏松。骨的形成起始于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的聚集，逐漸形成骨窩，隨后骨髓間充干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞分別通過膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨的方式形成新的骨組織。而負(fù)責(zé)骨吸收的細(xì)胞，主要是破骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞主要來源于造血干細(xì)胞，與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞有一定的相關(guān)性[3]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞是骨重塑和骨穩(wěn)態(tài)維持重要的幾種細(xì)胞，骨形成和骨吸收過程主要受特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和表觀遺傳因子的調(diào)控。從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞形成過程是一個(gè)程序性的分化過程，成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9、RUNX2和OSX/SP7依次激活，并受Wnt /β-catenin、TGF-β/BMP、MAPK/p38和Notch等通路調(diào)控[4]。而破骨細(xì)胞經(jīng)過核因子κB受體激活因子(RANK)激活后，改變自身的形態(tài)，細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生重排，并與骨表面形成緊密連接，通過分泌裂解酶抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和pro-cathepsin K組織蛋白酶K(pro-Catk)，侵蝕其結(jié)合的骨組織[5]。而以上兩個(gè)過程均受表觀遺傳調(diào)控如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控的影響，且越來越多的報(bào)道，lncRNAs在DNA 甲基化和組蛋白修飾等過程也起重要調(diào)控作用，并在骨形成和骨吸收過程發(fā)揮重要作用[6]。

3 LncRNAs在骨穩(wěn)態(tài)中調(diào)控作用

3.1 LncRNAs在骨形成中調(diào)控作用

骨形成主要是由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而成的成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞介導(dǎo)，并受特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因和表觀遺傳因子調(diào)控。LncRNAs廣泛參與表觀遺傳因子和多種基因表達(dá)調(diào)節(jié)，在生命發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展起重要作用。多項(xiàng)研究報(bào)道，lncRNAs 在成骨分化、成軟骨分化等骨形成過程起重要調(diào)控作用。

3.1.1 LncRNAs正向調(diào)節(jié)骨形成過程

3.1.1.1 H19促進(jìn)成骨分化：LncRNA H19在哺乳動(dòng)物中保守性較高，與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)[7]，其在成骨分化過程也具有重要調(diào)控作用[8]。H19可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，H19作為miR-675的前體，剪接產(chǎn)生成熟的miR-675-3p 和miR-675-5p，miR-675與H19在成骨分化過程表達(dá)上調(diào)，二者均可以促進(jìn)體外成骨分化和體內(nèi)異位骨形成，H19不僅可以抑制TGF-β表達(dá)，還可以下調(diào)TGF-β對(duì)Smad3的磷酸化水平，進(jìn)而抑制HDAC4/5與成骨關(guān)鍵基因RUNX2、OCN啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，發(fā)揮抑制成骨分化作用[9]。H19 還可以作為內(nèi)源競爭性RNA，通過吸附miR-141和miR-22而阻止miR-141和miR-22與Wnt/beta-catenin的結(jié)合，從而促進(jìn)成骨分化。最近在研究機(jī)械張力對(duì)人源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程發(fā)現(xiàn)，H19 可以競爭性結(jié)合miR-138，從而干擾miR-138與靶基因PTK2的調(diào)控，促進(jìn)下游FAK表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)械張力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)和骨形成[10]。目前對(duì)于H19 在成骨方向的研究很多，H19有望成為骨調(diào)控研究領(lǐng)域的重要lncRNA分子。

3.1.1.2 MALAT1促進(jìn)成骨分化和基質(zhì)礦化：LncRNA MALAT1與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)[11]。MALAT1可以促進(jìn)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和鈣化，MALAT1通過吸附miR-204來上調(diào)靶基因Smad4表達(dá)，激活的Smad4上調(diào)ALP、OCN表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化和胞外基質(zhì)的礦化[12]。并且有研究表明MALAT1還可以靶向miR-14，從而調(diào)節(jié)成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Osx表達(dá)[13]。

3.1.1.3 DANCR促進(jìn)成軟骨分化：SOX4可以上調(diào)lncRNA DANCR，促進(jìn)滑膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成軟骨分化[14]。DANCR直接結(jié)合于myc，增強(qiáng)myc基因的mRNA穩(wěn)定，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。而DANCR對(duì)成軟骨分化的促進(jìn)作用，是通過促進(jìn)Smad3和STST3 mRNA穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)的。且研究還發(fā)現(xiàn)DANCR可以下調(diào)miR-1305表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Smad4表達(dá)，激活TGF-β信號(hào)通路，促進(jìn)成軟骨分化和骨形成[15]。

3.1.2 LncRNAs反向調(diào)節(jié)骨形成過程

3.1.2.1 MEG3抑制成骨分化：多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中，下調(diào)lncRNA MEG3可以抑制成骨關(guān)鍵因子RUNX2、OSX、OCN 的表達(dá)，并抑制BMP4的轉(zhuǎn)錄。MEG3可將轉(zhuǎn)錄抑制因子SOX2從BMP4啟動(dòng)子區(qū)游離，從而激活BMP4的表達(dá)[16]。MEG3通過吸附miR-140-5p 發(fā)揮促進(jìn)成骨分化，抑制成脂分化過程[17]。而有報(bào)道在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中，MEG3可以上調(diào)miR-133a-3p的表達(dá)，進(jìn)而抑制骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[18]。

3.1.2.2 MIAT抑制體內(nèi)外骨形成：lncRNA MIAT首次發(fā)現(xiàn)與心肌梗死發(fā)病相關(guān)，在人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程表達(dá)下調(diào)，敲降MIAT可以在體內(nèi)水平促進(jìn)成骨分化，體外促進(jìn)骨形成。炎性因子TNF-α可以促進(jìn)骨吸收，誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而下調(diào)MIAT表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)TNF-α引起的成骨抑制和骨吸收作用[19]。對(duì)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中ONFH患者股骨頭標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)壞死組織中MIAT的RNA水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常股骨組織，抑制內(nèi)源性MIAT可以促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和骨形成[20]。

3.1.2.3 miR31HG調(diào)節(jié)炎性微環(huán)境下骨形成：miR31HG與細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生相關(guān)[21]。miR31HG在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程表達(dá)下調(diào)，敲降miR31HG表達(dá)不僅可以促進(jìn)骨形成，還可以逆轉(zhuǎn)炎性因子TNF-α和IL-17誘導(dǎo)的成骨抑制。NF-κB的P65 亞基可以結(jié)合于miR31HG的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)miR31HG的表達(dá)，而miR31HG可以直接結(jié)合IκBα，促進(jìn)其磷酸化，進(jìn)而參與NF-κB信號(hào)通路的激活。miR31HG-NF-κB二者互相調(diào)控，形成回路從而調(diào)節(jié)炎性微環(huán)境下骨形成[22]。

3.2 LncRNAs調(diào)控骨吸收過程

在骨骼系統(tǒng)不斷更新的過程中，來自單核/巨噬細(xì)胞造血系的破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨吸收過程。采用100 ng/mL RANKL和50 ng/mL M-CSF刺激活化RAW 264.7細(xì)胞，進(jìn)行破骨誘導(dǎo)，lncRNA芯片數(shù)據(jù)分析顯示，在前破骨細(xì)胞階段，有4 348個(gè)lncRNAs表達(dá)發(fā)生變化，其中1 643個(gè)lncRNAs上調(diào)，2 705個(gè)lncRNAs表達(dá)下降。在成熟的活化破骨細(xì)胞中，分別有1 896和2 706個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào)或下降，并通過GO分析和KEGG分析了差異表達(dá)的lncRNAs的主要通路，但并未對(duì)差異lncRNAs的具體功能進(jìn)行分析[23]。目前，關(guān)于lncRNAs調(diào)控破骨細(xì)胞和骨吸收功能的研究并不是很多，或許與破骨細(xì)胞分化模型較難重復(fù)有關(guān)，而進(jìn)行文章數(shù)據(jù)的深入挖掘，或許可以發(fā)現(xiàn)更多有意義lncRNAs。

3.2.1 LncRNA Jak3促進(jìn)破骨過程:分析單水合尿酸鈉(MSU)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞在破骨細(xì)胞分化過程中l(wèi)ncRNA和mRNA的共表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在破骨細(xì)胞譜系314對(duì)lncRNA-mRNA中22對(duì)與炎性反應(yīng)相關(guān)，而Jak3和Jak3共表達(dá)模式在破骨細(xì)胞中顯著上調(diào)。其中，Jak3通過正向調(diào)控破骨細(xì)胞因子Nfatc1的表達(dá)，參與MSU誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，并在痛風(fēng)患者的單核細(xì)胞中Jak3水平升高。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Jak3介導(dǎo)的NFATC1激活上調(diào)了組織蛋白酶K (Ctsk)的表達(dá)，Jak3在通過Jak3/NFATC1/Ctsk軸向分化破骨細(xì)胞中起著關(guān)鍵的功能作用[24]。

3.2.2 LncRNA-AK077216促進(jìn)破骨細(xì)胞分化:通過芯片檢測和qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK077216 (lnc-AK077216)的表達(dá)在破骨細(xì)胞發(fā)生過程中顯著上調(diào)。NFATc1是破骨細(xì)胞發(fā)生過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，而lnc-AK077216通過抑制NIP45的表達(dá)，促進(jìn)NFATc1的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的功能。此外，在卵巢去勢(shì)后小鼠骨髓組織中檢測到lnc-AK077216和Nfatc1表達(dá)上調(diào)，而Nip45表達(dá)下調(diào)，lnc-AK077216可以調(diào)控NFATc1的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和功能，為破骨細(xì)胞的形成提供了新的機(jī)制[25]。

4 問題與展望

LncRNAs在基因組中數(shù)量龐大，它們?cè)诙喾N調(diào)控水平參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖及分化等生物過程。LncRNAs不僅存在于各種組織中，已在全血、血清、尿液和細(xì)胞外囊泡中檢測到，這增加了它們作為疾病的生物標(biāo)志物的潛力，例如迄今發(fā)現(xiàn)的人類前列腺癌最特異的生物標(biāo)志物之一IncRNA PCA3。考慮到IncRNAs的大小和細(xì)胞位置，試圖敲除或過度表達(dá)這些lncRNAs作為治療疾病的手段面臨著一定挑戰(zhàn)，但最近的進(jìn)展為該領(lǐng)域帶來了新的改進(jìn)。目前有多種方法可以改變lncRNAs的表達(dá)，包括使用病毒或非病毒載體、基于RNA或基因組編輯方法。如殼聚糖用于非病毒基因的傳遞既高效又無毒，基于鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)的gapmers以及多聚體或多靶點(diǎn)寡核苷酸可以實(shí)現(xiàn)更高的干擾效率和更低的給藥劑量，并且通過CRISPR-Cas9復(fù)合物也可以控制lncRNA的表達(dá)。

盡管目前發(fā)現(xiàn)有許多l(xiāng)ncRNAs表達(dá)與骨形成和骨吸收過程密切相關(guān)，但lncRNAs如何調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞譜系分化的研究尚處于起步階段，更深入的調(diào)控機(jī)制需要大量研究去探索。并且目前關(guān)于lncRNAs在破骨細(xì)胞分化和骨吸收方面的研究還很少，也未見lncRNAs應(yīng)用于骨代謝疾病的診斷和治療的報(bào)道。

隨著基因組學(xué)與生物信息學(xué)的發(fā)展，許多關(guān)于lncRNAs的數(shù)據(jù)庫不斷出現(xiàn)，為lncRNAs的研究提供更多可參考資源?？梢灶A(yù)測，在未來幾年，這一領(lǐng)域的研究興趣將顯著增加，并提供有關(guān)參與骨骼發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)調(diào)控的新知識(shí)。這些發(fā)現(xiàn)將對(duì)了解骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病，以及確定治療這些疾病的新治療策略產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。