郝鳳棲 梁永新 范中元 屠后安 張冰 夏婧 褚海辰

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,山東 青島 266003)

長(zhǎng)期應(yīng)用阿片類藥物導(dǎo)致的抗傷害性耐受是疼痛診療中的重要問題。小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的神經(jīng)炎癥參與了抗傷害性耐受的形成[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)有M1經(jīng)典激活狀態(tài)和M2替代激活狀態(tài)，M1型激活狀態(tài)主要釋放促炎因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1β)等，并參與嗎啡耐受的形成[2-4]。研究小膠質(zhì)細(xì)胞M1型激活狀態(tài)有利于進(jìn)一步了解嗎啡耐受形成機(jī)制。阿片類藥物作用的主要靶點(diǎn)有μ阿片受體(MOR)、δ阿片受體(DOR)及κ阿片受體。MOR與DOR廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及外周組織，能調(diào)節(jié)多種生理效應(yīng)。研究表明MOR與DOR結(jié)合產(chǎn)生的異聚體參與了嗎啡耐受的形成[3]。μ/δ阿片受體異聚體干擾肽(MORTM1-TAT)是一種人工合成的μ/δ阿片受體異聚體(MDOR)干擾劑[4]。脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞促炎M1型活化狀態(tài)及促炎因子的釋放可能與嗎啡耐受發(fā)展機(jī)制相關(guān)。MDOR參與調(diào)控痛覺缺失，我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)提示其與嗎啡耐受過程存在關(guān)聯(lián)。本研究提取大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，初步探討在嗎啡的刺激下，MDOR在體外調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型激活狀態(tài)及促炎因子TNF-α、IL-1β表達(dá)中的作用，為防治嗎啡耐受提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

MORTM1-TAT(美國(guó)MedChemexpress公司)；CD86一抗(德國(guó)Sigma-aldrich公司)；μ阿片受體一抗(美國(guó)Abcam公司)；δ阿片受體一抗(美國(guó)Abnova公司)；GAPDH兔抗大鼠一抗(Elabscience公司)；羊抗兔二抗(德國(guó)Sigma-aldrich公司)；TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司)。

1.2 大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

從出生1～2 d的Wistar大鼠中取出新鮮脊髓組織，置于4 mL冰冷的Hanks平衡鹽溶液中研磨，然后以1 000 r/min離心10 min分離原代細(xì)胞。將細(xì)胞置于含有100 kU/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取狀態(tài)穩(wěn)定的對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組及處理

將細(xì)胞懸液以5×107/L的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度約60%時(shí)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(A組)、溶劑組(B組)、嗎啡組(C組)、嗎啡+MORTM1-TAT組(D組)4組。A組細(xì)胞加入50 μL DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行孵育，B組加入等劑量PBS溶劑進(jìn)行孵育，C組加入終濃度為100 μmol/L的嗎啡進(jìn)行孵育，D組加入8 μmol/L MORTM1-TAT孵育2 h后加入終濃度為100 μmol/L嗎啡進(jìn)行孵育，72 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的表達(dá)

孵育完畢后收集細(xì)胞上清液，置于-20 ℃冰箱低溫保存。以ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的表達(dá)情況，具體操作步驟嚴(yán)格依照TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞M1表型標(biāo)志物CD86、MDOR的表達(dá)

孵育后使用多聚甲醛固定細(xì)胞，30 min后，使用0.01 mol/L PBS漂洗5 min，共3次；隨后加入由PBS配制的Triton X-100，以0.01 mol/L PBS漂洗以后，使用體積分?jǐn)?shù)0.05的正常羊血清室溫封閉60 min；甩去多余的封閉液，加合適濃度的一抗(分別為CD86抗體、MOR抗體、DOR抗體)，4 ℃冰箱過夜；以濃度0.01 mol/L的PBST漂洗5 min，共4次；加入合適濃度的熒光標(biāo)記二抗，避光、室溫孵育2 h；以0.01 mol/L PBST漂洗3次，每次5 min(注意避光)；吸除多余的水滴并加入50 μL的抗淬滅封片劑(含DAPI)進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察并且拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小膠質(zhì)細(xì)胞中MDOR的表達(dá)情況

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B、C、D組的免疫熒光強(qiáng)度值分別為184.9±38.5、198.7±57.4、905.8±61.7、254.9±28.6，4組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=154.56，P<0.05)；與A組相比較，B組的MDOR表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；與B組相比較，C組細(xì)胞中MDOR的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與C組相比，D組細(xì)胞中MDOR表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

2.2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞CD86的表達(dá)情況

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B、C、D組的免疫熒光強(qiáng)度值分別為108.5±5.5、117.2±19.4、836.5±75.8、297.8±86.0，4組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.87，P<0.05)；與A組相比，B組CD86表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；與B組相比，C組細(xì)胞中CD86蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與C組相比較，D組細(xì)胞中CD86蛋白的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B、C、D組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平分別為(0)、(0)、(12.21±0.90)、(3.28±0.33)ng/L；A、B、C、D組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平分別為(0)、(0)、(27.65±1.87)、(6.47±0.95)ng/L,各組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=434.70、463.50，P<0.05)；與A組相比，B組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β的水平無明顯變化(P>0.05);與B組相比，C組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的水平明顯升高(P<0.05)；與C組相比，D組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β的水平明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

阿片受體是抑制性G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)，多數(shù)GPCR易于形成異聚體，異聚化是受體成熟與信號(hào)輸入和轉(zhuǎn)運(yùn)的必要條件。本研究結(jié)果顯示，嗎啡長(zhǎng)時(shí)間孵育會(huì)顯著增加小膠質(zhì)細(xì)胞中MDOR的表達(dá)，并使小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1型激活。DOR和MOR的功能性合作被認(rèn)為是疼痛相關(guān)途徑中的細(xì)胞基礎(chǔ)。在離體細(xì)胞研究中，DOR通過結(jié)合MOR形成異聚物，使得MOR能夠更穩(wěn)定地存在于細(xì)胞表面發(fā)揮作用[5]。嗎啡可以通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞中MOR導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子釋放增加，同時(shí)DOR可通過穩(wěn)定膜表面MOR放大MOR效應(yīng)從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)性增加。我們推測(cè)MORTM1-TAT可干擾脊髓中MDOR的形成，從而促進(jìn)MDOR的降解并增強(qiáng)阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用，這也是我們團(tuán)隊(duì)未來關(guān)注的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中MORTM1-TAT抑制小膠質(zhì)細(xì)胞促炎M1型激活可能是由于DOR和MOR單體容易降解，導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)性下降；也可能是由于直接的MDOR信號(hào)下降造成的。小膠質(zhì)細(xì)胞中MOR從DOR上解離或許是改善阿片類鎮(zhèn)痛治療的潛在策略。

本研究結(jié)果表明，嗎啡可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子TNF-α和IL-1β的釋放增加，而MORTM1-TAT能夠抑制促炎因子TNF-α和IL-1β釋放。在長(zhǎng)期阿片類藥物應(yīng)用后，脊髓背角處小膠質(zhì)細(xì)胞激活并分泌疼痛相關(guān)促炎細(xì)胞因子，從而損害嗎啡鎮(zhèn)痛作用并誘導(dǎo)嗎啡耐受[6]。有研究表明神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型激活參與促炎性細(xì)胞因子釋放，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象一致[7]。本研究結(jié)果顯示，嗎啡作用后，小膠質(zhì)細(xì)胞CD86蛋白表達(dá)及TNF-α以及IL-1β的水平均增高，提示嗎啡刺激能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型分化并且促進(jìn)炎性遞質(zhì)的分泌。MOR和DOR在脊髓組織中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中[8-9]。研究表明嗎啡可以通過MOR介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、激活與凋亡[10]。MOR的激活可增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型，伴隨著TNF-α、IL-1β等促炎因子的釋放增加[11-12]，嗎啡在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中通過MOR信號(hào)通路增強(qiáng)了IL-1β、TNF-α等的釋放，從而介導(dǎo)了小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型[12-14]。這些研究均提示MOR與M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化密切相關(guān)，但并沒有進(jìn)一步探索阿片受體異聚化對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)及促炎因子釋放的影響。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)MORTM1-TAT處理后，細(xì)胞TNF-α、IL-1β的釋放減少，提示μ/δ阿片受體異聚化可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞M1型促炎激活狀態(tài)的形成。有報(bào)道稱，慢性嗎啡處理后，大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，TNF-α和IL-1β能夠顯著減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛效果，應(yīng)用TNF-α以及IL-1β受體拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受[15]，這兩種促炎因子的釋放可能是導(dǎo)致嗎啡耐受的主要機(jī)制之一，而MORTM1-TAT的使用或許也是逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受的原因。本研究中，MORTM1-TAT并不能完全抑制嗎啡誘導(dǎo)的TNF-α以及IL-1β釋放，可能是由于MORTM1-TAT不能完全干擾DOR和MOR的結(jié)合，也可能是由于存在其他信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥因子的釋放，但仍需進(jìn)一步的證實(shí)。

綜上所述，本研究表明，干擾MDOR形成能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型分化，并降低小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的釋放，為防治嗎啡耐受提供了一定的理論依據(jù)。