(青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266555)

病理學(xué)是介于臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)之間的橋梁學(xué)科，被喻為疾病最后診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。病理學(xué)發(fā)展大體歷經(jīng)三個階段：器官病理學(xué)、細(xì)胞病理學(xué)、分子病理學(xué)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)病理學(xué)的融合，病理學(xué)發(fā)生了革命性的進(jìn)步，進(jìn)行了重新的整合，步入病理學(xué)的第三個階段——分子病理學(xué)。分子病理學(xué)是病理學(xué)和多個學(xué)科相結(jié)合形成的一門新的分支學(xué)科，主要是從核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子水平研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為疾病的診療提供依據(jù)[1]。

肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床上最常見的類型，約占全部肺癌的85%。我國NSCLC的發(fā)病率大約為53.57/100 000，男性略高于女性[2]。晚期NSCLC 患者的傳統(tǒng)治療以第三代化療藥聯(lián)合鉑類藥物化療為主，但療效已達(dá)平臺期，中位總生存期(OS)約為8個月，2年生存率約為12%，患者很難再從中進(jìn)一步獲益[3]。分子病理學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使NSCLC疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究更深入和精細(xì)，使精準(zhǔn)治療成為可能，從而顯著延長了患者的生存時間，提升了患者的生存質(zhì)量。

目前與NSCLC診療相關(guān)的分子病理學(xué)技術(shù)包括免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)、原位雜交(ISH)技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相關(guān)技術(shù)及生物芯片技術(shù)等。

1 IHC技術(shù)

1941年COONS[4]創(chuàng)立了細(xì)胞化學(xué)中的“免疫細(xì)胞化學(xué)”，使用熒光素標(biāo)記的抗體成功檢測到肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌。經(jīng)過幾十年的不斷發(fā)展，從最初的直接免疫熒光標(biāo)記方法，逐漸發(fā)展為免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫金-銀組織化學(xué)技術(shù)等。

IHC利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，首先通過抗體識別組織細(xì)胞內(nèi)的抗原(多肽和蛋白質(zhì))，然后再通過化學(xué)反應(yīng)使抗體上標(biāo)記的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，最終對組織細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定位、定性及定量研究。該方法具有特異度及靈敏度高、定位準(zhǔn)確、形態(tài)學(xué)與功能學(xué)相結(jié)合等優(yōu)點，目前越來越多地用于臨床病理診斷、腫瘤良惡性和轉(zhuǎn)移瘤來源判斷、預(yù)后評估及基礎(chǔ)科學(xué)研究。在分子病理學(xué)技術(shù)中，IHC技術(shù)是評估蛋白質(zhì)表達(dá)水平最簡單、最實用的方法，不僅能進(jìn)行半定量檢測、細(xì)胞內(nèi)定位，還能對蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況(如蛋白質(zhì)磷酸化等)進(jìn)行檢測。

在NSCLC中，IHC檢測主要用來進(jìn)行輔助診斷。對于形態(tài)學(xué)上不能明確的NSCLC手術(shù)樣本，一般會用TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6、P63對肺腺癌、肺鱗癌進(jìn)行鑒別診斷[5-7]；對于晚期NSCLC的活檢樣本，也要盡可能地使用TTF-1、P40兩個IHC指標(biāo)對肺腺癌、肺鱗癌進(jìn)行鑒別診斷[6-7]。除此之外，還可以利用IHC技術(shù)對NSCLC和其他的腫瘤進(jìn)行鑒別診斷，比如神經(jīng)內(nèi)分泌癌、惡性間皮瘤等[7-9]。對于NSCLC來說，IHC檢測除了可作為一種鑒別診斷的手段外，還可為靶向用藥提供依據(jù)。中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)原發(fā)性肺癌診療指南中推薦可以通過Ventana免疫組化檢測ALK融合來指導(dǎo)ALK抑制劑的應(yīng)用。此外，還可以采用兔抗人EGFR L858R單克隆抗體和兔抗人EGFR E746-A750單克隆抗體檢測NSCLC樣本中的EGFR基因L858R和E746-A750del的突變狀態(tài)，與熒光定量PCR法相比，兩種方法對基因突變狀態(tài)的檢測具有較高一致性，因此對于沒有條件進(jìn)行PCR檢測的醫(yī)院，可以通過此種方法判斷NSCLC患者能否進(jìn)行酪氨酸激酶抑制劑治療[10-11]。

2 ISH技術(shù)

ISH技術(shù)利用堿基配對的原理，首先使標(biāo)記了標(biāo)記物的核酸探針與組織細(xì)胞內(nèi)的待測核酸雜交，然后再通過一系列的組織化學(xué)或者IHC方法使探針上的標(biāo)記物顯色，對待測核酸進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。ISH主要分為：基因組原位雜交(GISH)、熒光原位雜交(FISH)、多彩色熒光原位雜交(M-FISH)和原位PCR。除此之外，根據(jù)探針標(biāo)記物的不同還可分為FISH、顯色原位雜交(CISH)以及銀染原位雜交(SISH)。

在NSCLC中，可以利用FISH來檢測某個基因的拷貝數(shù)增多和結(jié)構(gòu)變異情況。對于NSCLC的ALK基因的結(jié)構(gòu)變異檢測，F(xiàn)ISH被認(rèn)為是ALK檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)常用于其他ALK檢測方法的驗證[12]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)肺癌診療指南推薦使用FISH技術(shù)進(jìn)行ALK、ROS1、RET基因重排和MET基因擴(kuò)增的檢測。此外，M-FISH還被用于肺癌的早期診斷。腫瘤的發(fā)生發(fā)展多伴有遺傳學(xué)改變，在許多實體腫瘤(包括肺癌)中經(jīng)常能見到染色體數(shù)目變異(尤其是非整倍體)。因此，可以通過染色體數(shù)目變異檢測實現(xiàn)對肺癌的早期診斷及肺癌與肺良性病變的鑒別診斷[13]。

3 PCR相關(guān)技術(shù)

PCR技術(shù)可以模擬體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，大量擴(kuò)增微量DNA。PCR技術(shù)誕生不足40年的時間里得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并衍生出了一系列的相關(guān)技術(shù)，如第一代測序、實時熒光定量PCR(qPCR)、數(shù)字PCR (dPCR)、第二代測序(NGS)技術(shù)等，這些技術(shù)在NSCLC的分子病理檢測中發(fā)揮著重要作用。

3.1 第一代測序技術(shù)

第一代測序技術(shù)的萌芽早于PCR技術(shù)的發(fā)明。成熟的第一代測序技術(shù)主要包括化學(xué)降解法和雙脫氧鏈終止法。目前應(yīng)用最廣泛的美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)3730系列自動測序儀利用的測序技術(shù)就是雙脫氧鏈終止法，同時使用了毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)。第一代測序技術(shù)的出現(xiàn)使人類獲得了探索生命遺傳信息的能力。人類基因組計劃(HGP)正是利用這種技術(shù)，成功完成了人類基因組30億個堿基對的測序和人類基因圖譜繪制，發(fā)現(xiàn)了大量腫瘤相關(guān)基因以及藥物靶基因，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展[14]。美國重大科研項目——“癌癥基因組圖集”(TCGA)計劃極大的豐富了NSCLC的基因圖譜。Sanger測序法作為最經(jīng)典的第一代測序技術(shù)，具有測序讀長長、準(zhǔn)確性高的特點，是最早應(yīng)用于EGFR基因檢測的一種技術(shù)，主要進(jìn)行EGFR18～21四個外顯子的測序，可以檢測待測區(qū)域內(nèi)的所有變異類型，尤其是一些稀有變異和未知變異，被當(dāng)作是EGFR檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[15]。目前NSCLC相關(guān)的靶基因多達(dá)十幾個，臨床上需求更多的是進(jìn)行多基因共檢而不是單個基因的檢測，因此Sanger測序已經(jīng)不能很好地滿足NSCLC基因檢測的需求。但是，作為基因序列測定的金標(biāo)準(zhǔn)，Sanger測序經(jīng)常會用于qPCR、普通PCR、NGS等方法的基因突變檢測結(jié)果的驗證。

3.2 qPCR技術(shù)

根據(jù)熒光標(biāo)記方法的不同，qPCR技術(shù)可以分為熒光染料法以及熒光探針法。前者主要有Pico Green染料法和SYBR Green染料法，后者主要有水解探針法以及分子信標(biāo)法等。水解探針法中應(yīng)用最廣泛的是TapMan探針法，即在PCR反應(yīng)體系中加入了一個特異的熒光標(biāo)記探針。分子信標(biāo)法目前應(yīng)用最多的是Scorpions突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)法。ARMS技術(shù)主要是在引物序列的3′端人為添加錯配堿基，增加擴(kuò)增特異性，用于基因突變檢測。TapMan探針法或ARMS技術(shù)均可以檢測已知基因的突變，但相比較而言，ARMS檢測方法具有更高的靈敏度以及特異度[16-18]。目前ARMS-PCR技術(shù)廣泛地應(yīng)用于NSCLC的EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、NRAS等基因的檢測，但是ARMS技術(shù)具有一定的局限性，只能檢測已知基因變異，不能進(jìn)行高通量檢測，不能檢測未知變異，同時對某些稀有變異和拷貝數(shù)變異也會出現(xiàn)漏檢。另外，標(biāo)本類型、腫瘤細(xì)胞含量、DNA濃度和質(zhì)量、加樣誤差及氣溶膠污染等問題也會影響ARMS檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。

3.3 dPCR技術(shù)

dPCR的基本原理是“分而治之”。首先把樣本分成很多份，少則幾十份，多則幾萬份，然后平均分配到各個反應(yīng)單元中，每個反應(yīng)單元中的待測核酸數(shù)量符合泊松分布，包含零個到多個待測核酸，理想狀態(tài)下為1個。待測核酸在每個反應(yīng)單元中獨立地進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行檢測，根據(jù)泊松分布和熒光信號陽性的反應(yīng)單元占比來計算待測核酸序列的拷貝數(shù)。在dPCR反應(yīng)中熒光信號的產(chǎn)生過程基本與qPCR相同。dPCR主要分為微反應(yīng)室/孔板dPCR、微流控芯片dPCR(cdPCR)以及微滴dPCR(ddPCR)三大類dPCR。后兩種則是目前主要的商業(yè)化的dPCR技術(shù)。ddPCR技術(shù)以美國Bio-Rad公司的QX200系統(tǒng)以及美國Raindance Technogies公司的RainDrop為代表。cdPCR技術(shù)以美國Fluidigm公司的BioMark HD系統(tǒng)以及美國Life Techonolgy公司的QuantStudio 3D系統(tǒng)為代表。

dPCR具有高靈敏度、高精確性、高耐受性和絕對定量的優(yōu)點，因此特別適合用于稀有基因變異檢測、拷貝數(shù)變異分析和復(fù)雜樣本基因表達(dá)研究等。對于NSCLC獲得性耐藥患者的循環(huán)腫瘤DNA的T790M突變情況的檢測，ddPCR方法的檢出率要明顯高于ARMS技術(shù)[19]，因此ddPCR技術(shù)特別適合于對NSCLC患者用藥后的動態(tài)監(jiān)測。

3.4 NGS

NGS又稱為高通量測序，其具備Sanger檢測技術(shù)所沒有的高性能——高通量、快速、高準(zhǔn)確性以及低成本等優(yōu)點。NGS主要包括有全基因組測序(WGS)、全外顯子組測序(WES)以及目標(biāo)區(qū)域測序(TRS)。與傳統(tǒng)檢測方法相比較，WGS可以在全基因組水平上檢測基因變異，涉及人類所有基因，能及時發(fā)現(xiàn)未知變異，更好地完善NSCLC相關(guān)基因圖譜。SHAO等[20]利用Ion Torrent平臺進(jìn)行靶向下一代測序，在 58例臨床病例中發(fā)現(xiàn)了與肺腺癌相關(guān)的突變譜。但是臨床上對于NSCLC患者選擇靶向用藥或者預(yù)后預(yù)測方面，用的更多的是TRS技術(shù)，這主要是因為NSCLC的基因變異主要集中在EGFR、ALK、ROS1、RAS、BRAF、RET、HER-2等基因上，而且部分基因還存在熱點突變，比如EGFR的熱點突變主要集中在19～21外顯子區(qū)域。除此之外，NGS技術(shù)還可以用于腫瘤組織突變負(fù)荷(TMB)檢測，用于預(yù)測NSCLC患者能否從免疫治療中獲益。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，TMB高的患者，與單純的化療相比，免疫治療可以明顯地提高無進(jìn)展生存期(PFS)和OS[21-22]。

4 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是指采用原位合成法或點樣法等方法，將組織、細(xì)胞或核酸、蛋白質(zhì)、糖類等生物大分子固定于固相載體上構(gòu)成高密度微陣列，通過相應(yīng)的檢測系統(tǒng)實現(xiàn)對生物樣品的分析，具有快速高效、高并行性、高通量、微型化、自動化以及成本低等優(yōu)點[23]。生物芯片主要有基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織芯片等。美國Affymatrix公司研發(fā)的基因芯片標(biāo)志著生物芯片的誕生。基因芯片技術(shù)是分子生物學(xué)與計算機(jī)技術(shù)、高分子化學(xué)合成技術(shù)、微電子技術(shù)等多學(xué)科相互結(jié)合形成的一門新型生物學(xué)技術(shù)，可用于基因表達(dá)圖譜的繪制，探索疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制、發(fā)現(xiàn)診療相關(guān)的靶基因，闡述基因功能，輔助蛋白組計劃的實施。此外，基因芯片還可以用于檢測基因多態(tài)性及基因變異。蛋白質(zhì)芯片是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有力工具，主要有蛋白質(zhì)檢測芯片和蛋白質(zhì)功能芯片兩大類。在臨床醫(yī)學(xué)研究中,研究者經(jīng)常利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)尋找新的腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤早期的診斷和預(yù)后評估，如WANG等[24]利用C-12多腫瘤蛋白質(zhì)芯片檢測系統(tǒng)對224例肺癌患者、159例肺良性病變的患者以及90例健康者進(jìn)行了血清CA125、CA19-9、鐵蛋白、CA15-3、CA242、CEA、AFP、NSE、PSA、f-PSA、HGH、β-HGH的檢測，發(fā)現(xiàn)肺癌組織C-12的陽性率為77.23%,高于肺良性病變的組織(13.84%)和健康對照組織(9.76%)。除此之外，蛋白質(zhì)芯片也可以用于對NSCLC發(fā)病機(jī)制的研究，如VANMETER等[25]利用反向蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究EGFR突變以及其磷酸化引起NSCLC發(fā)病的具體信號機(jī)制，發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者的細(xì)胞群體中EGFR Tyr-1148以及Tyr-1068同時上調(diào)，而HER2 Tyr-1248和EGFR Tyr-1045同時下調(diào)，認(rèn)為細(xì)胞癌變可能與以上因素引起的PI3K/AKT/mTOR等信號通路持續(xù)激活、EGFR泛素化速率和轉(zhuǎn)化抑制能力降低有關(guān)。組織芯片結(jié)合了分子生物學(xué)和組織形態(tài)學(xué)的優(yōu)勢，主要用于各類原位組織技術(shù)實驗，結(jié)合IHC、ISH、原位PCR等技術(shù)，可以針對細(xì)胞、核酸以及蛋白質(zhì)等進(jìn)行形態(tài)學(xué)與功能學(xué)的研究[26-27]。在NSCLC研究方面,組織芯片技術(shù)主要用于疾病的病因?qū)W研究、診斷、鑒別診斷、治療和預(yù)后評估, 同時通過這一技術(shù)還可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與肺癌相關(guān)的特異性基因表達(dá)產(chǎn)物和免疫標(biāo)記物。

隨著醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的分子病理學(xué)技術(shù)應(yīng)用于NSCLC的診療中，為NSCLC患者提供靶向治療和免疫治療的依據(jù)，從而極大地延長了患者的OS和PFS。但是由于受到技術(shù)、成本的限制以及試劑、樣本局限性等的影響，某些分子病理學(xué)技術(shù)(如NGS、生物芯片技術(shù)等)在醫(yī)院病理科的開展受到一定的限制，因此后續(xù)應(yīng)該致力于優(yōu)化技術(shù)、簡化實驗流程、降低成本，使更多的分子病理學(xué)技術(shù)能應(yīng)用于臨床診療，真正地服務(wù)于臨床、服務(wù)于患者。