哈麗娟, 王富春, 劉曉娜

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院實(shí)驗(yàn)針灸教研室，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿研究所，吉林 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸臨床教研室，吉林 長春 130117）

胃潰瘍是常見的胃和十二指腸潰瘍性疾病，表現(xiàn)為惡心、燒灼感、噯氣、嘔吐、嘔血、胃酸和便血等， 以反復(fù)發(fā)作的節(jié)律性胃脘部痛為典型癥狀［1］。本 病 屬 中 醫(yī) “反 酸” 和 “噯 氣” 范 疇，西 醫(yī)認(rèn)為胃潰瘍是黏膜消化性疾病，因多種因素對胃黏膜造成損傷而引起胃蛋白酶和胃酸升高導(dǎo)致，全世界范圍內(nèi)患病率為10%［2-3］。 胃潰瘍給患者的身體、心理健康、生活和工作帶來嚴(yán)重影響，患者在患病早期，因?qū)Ρ静×私獠蛔慊虿粔蛑匾?，?dǎo)致病情加重，甚至造成糜爛性潰瘍和胃穿孔等嚴(yán)重后果，患病后需及時(shí)治療［4-5］。對于胃潰瘍的治療，目前西醫(yī)的方法比較單一，且不良反應(yīng)較多。多項(xiàng)研究［6-10］表明：針灸可有效治療胃潰瘍，并緩解疼痛和吞酸等癥狀。腧穴的選擇是針灸取得良好療效的重要影響因素［11］，歷代醫(yī)家［12-14］對腧穴配伍可提高針灸治療胃潰瘍的臨床療效早有共識，提出了許多配伍方法，現(xiàn)代腧穴配伍研究［15］也取得了一定成果，然而腧穴配伍療效是否優(yōu)于單穴尚無充分的科學(xué)依據(jù)，影響腧穴配伍效應(yīng)的關(guān)鍵因素也尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)以正常SD 大鼠和應(yīng)激性胃潰瘍模型大鼠為研究對象，采用束縛-水浸應(yīng)激法造模，綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)法和免疫組織化學(xué)法檢測電針單穴及腧穴配伍后胃潰瘍模型大鼠胃黏膜損傷指數(shù)和胃組織中上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR） 蛋白表達(dá)情況， 探討單穴及腧穴配伍對胃潰瘍大鼠的干預(yù)效應(yīng)差異及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器100 只健康雄性SD 大鼠由長春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF 級，體質(zhì)量180～220 g，飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物室，相對濕度為60%～70%， 溫度（22±2） ℃， 人工照明，自由飲水。氯化鈉、氨基甲酸乙酯、多聚甲醛、石蠟、二甲苯、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、梯度乙醇、無水乙醇和蘇木精染料溶液（吉林省長春市賽因生物科技有限公司），DAB 顯色試劑盒、山羊血清和兔抗大鼠多克隆抗體（美國Sigma 公司），生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（德國Serva公司）。 820 型薄片切片機(jī)（美國AO 公司），UPW-25N 超純水器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司）， 全套實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)器械（河南省南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理方式100 只健康雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中脘組、足三里組和合募配伍組，每組20 只。空白組：不造模，不治療，正常飼養(yǎng)；模型組：造模后不進(jìn)行電針治療；中脘組：模型成功后， 電針中脘穴， 連續(xù)10 d；足三里組：模型成功后，電針足三里穴，連續(xù)10 d；合募配伍組：模型成功后，電針合募配伍（足三里+中脘穴），連續(xù)10 d。

1.3模型制備采用國際上公認(rèn)的應(yīng)激性胃潰瘍造模方法-束縛-浸水應(yīng)激法造模［16-17］，造模24 h 之前，大鼠禁食不禁水，放置于長為20.0 cm、直徑為6.5 cm 的管狀金屬網(wǎng)中，懸浮于（18±2）℃的水中，水位達(dá)到大鼠的劍突處，時(shí)間為12 h，制備應(yīng)激性胃潰瘍大鼠模型。

1.4各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)檢測10 d 后處死各組大鼠，取出胃組織，沿胃大灣剪開胃壁，將胃體翻轉(zhuǎn)，使胃內(nèi)面暴露于外，采用0.9% NaCl 溶液和PBS 清洗去除污血，平置于冰塊上，在10 倍放大鏡下觀察胃黏膜組織形態(tài)表現(xiàn)。 參考ELIA 等［18］制定的胃黏膜損傷指數(shù)分析方法，斑點(diǎn)糜爛計(jì)1 分，糜爛長度＜1 mm 計(jì)2 分，1 mm≤糜爛長度＜2 mm 計(jì)3 分，2 mm≤糜爛長度≤4 mm計(jì)4 分，糜爛長度＞4 mm 計(jì)5 分；胃黏膜糜爛的計(jì)分值之和為胃黏膜損傷指數(shù)。

1.5 HE染色觀察各組大鼠胃組織病理形態(tài)表現(xiàn)取一小塊大鼠胃組織（5 mm×10 mm×10 mm），多聚甲醛固定脫水，4 ℃過夜，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，采用45 ℃培養(yǎng)箱干燥，二甲苯脫蠟，水化，蒸餾水洗滌，蘇木精染色，脫水，二甲苯透明，復(fù)玻片封口，普通光鏡下觀察各組大鼠胃組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達(dá)水平①取一小塊胃黏膜組織（5 mm×10 mm×10 mm），采用4% 多聚甲醛固定后，埋入石蠟進(jìn)行切片，采用防脫片載玻片貼片，在60 ℃下采用烤箱烤切片30 min，采用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟； ②分別在不同梯度（100%、 95%、90% 和80%） 酒精中進(jìn)行水化，各3 min，在蒸餾水中洗滌3 次，每次各2 min ； ③將 組 織 切 片 放入10 mmol·L－1（pH 6.0） 檸檬酸鹽緩沖液中高溫高壓修復(fù)3 min，自然冷卻30 min 后，PBS 浸洗3 次；④于組織切片上加入封閉血清，排除非特異性染色造成的干擾并孵育；⑤組織切片加入一抗溶液，于4 ℃條件下孵育過夜；⑥第二天于37 ℃條件下復(fù)溫60 min，PBS 溶液洗滌，切片組織加滴二抗山羊抗兔IgG 溶液，孵育60 min；⑦PBS 溶液，切片滴入過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min；⑧采用PBS 溶液沖洗，DAB 顯色液滴于每張切片組織上，鏡下隨時(shí)觀察，以確定顯色程度，之后蒸餾水反復(fù)清洗；⑨采用蘇木精復(fù)染，蒸餾水反復(fù)沖洗； ⑩梯度酒精分化， 每個(gè)濃度2 次，每次各2 min；二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明，取出切片，擦干周圍二甲苯，中性樹膠滴在組織旁，再用清潔蓋玻片蓋上，先放平一側(cè)，再放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。結(jié)果判定：陽性結(jié)果為細(xì)胞膜上或細(xì)胞質(zhì)中有黃色或棕黃色的EGFR 蛋白質(zhì)染色。每個(gè)樣本拍攝3 個(gè)不同位置，采用Image-Pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)測定EGFR 蛋白質(zhì)染色積分吸光度 （integral absorbance，IA） 值，以IA 值代表各組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)和胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達(dá)水平以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠胃黏膜潰瘍情況肉眼觀察各組大鼠胃黏膜潰瘍情況可見：空白組大鼠胃黏膜顏色粉紅，無病灶和出血點(diǎn)；模型組大鼠胃黏膜顏色鮮紅，有明顯潰瘍灶及大面積的出血點(diǎn)；中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜潰瘍程度均有不同程度的減輕，合募配伍組大鼠胃黏膜潰瘍程度減輕最明顯。見圖1 （插頁二）。

2.2各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)空白組、模型組、中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)分別為（1.06±0.29）、（42.33±3.57）、（25.85±6.22）、（23.63±5.32） 和（17.22±2.13） 分，模型組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)最高，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明束縛-浸水應(yīng)激法成功建立了應(yīng)激胃潰瘍大鼠模型；與模型組比較，中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；合募配伍組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)大于中脘組和足三里組，中脘組和足三里組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3各組大鼠胃組織病理形態(tài)表現(xiàn)空白組大鼠胃組織和竇壁結(jié)構(gòu)完整，固有腺體排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠胃黏膜被破壞，腺體數(shù)量減少，形狀和大小不一，排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤存在于細(xì)胞間隙；中脘組和足三里組大鼠黏膜細(xì)胞排列紊亂，可見部分細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤，組織學(xué)改變輕于模型組；合募配伍組大鼠大部分胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，上皮較完整，細(xì)胞水腫輕度，伴有少數(shù)炎癥細(xì)胞。中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜均有不同程度的修復(fù)與愈合，效果以合募配伍組最佳。見圖2 （插頁二）。

2.4各組大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達(dá)水平空白組、模型組、中脘組、足三里組和合募配伍組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達(dá)水平分別為0.68±0.12、 1.22±0.45、 2.52±0.36、 2.96±0.33 和4.33±0.31。 模 型 組 大 鼠 胃 黏 膜 組 織 中EGFR 蛋白表達(dá)水平高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，中脘組、足三里組和合募配穴組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與中脘組比較，足三里組大鼠胃黏膜組織中EGFR蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），合募配伍組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與足三里組比較，合募配伍組大鼠胃黏膜組織中EGFR 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

3 討 論

2002 年，世界衛(wèi)生組織在《針灸臨床研究報(bào)告的回顧與分析》 中，詳細(xì)分析了針灸治療病癥的范圍及療效，肯定了消化性胃潰瘍是針灸治療適宜病癥，大量國內(nèi)外臨床及基礎(chǔ)研究也證明了針灸對消化性胃潰瘍的有效性， 總有效率為75.0%～96.7%［19］。

合募配伍是本課題組經(jīng)過多年臨床總結(jié)出的一種取穴簡便、配伍精煉和行之有效的腧穴配伍方法，本課題組在國內(nèi)首次提出 “合募配穴治療六腑病” 的理論，并對合募配穴進(jìn)行了較為深入的理論研究和配伍特點(diǎn)分析［20］。中脘穴是治療脾胃疾病的常用穴，屬任脈，為任脈、手太陽與少陽、足陽明之會，是八會穴之腑會，是六腑之氣匯聚之處，具有和胃健脾、降逆利水、化濕導(dǎo)滯、理氣化痰、安神定志之功，《循經(jīng)考穴編》 記載：“一切脾胃之疾，無所不療”；孫思邈《備急千金要方》 云：“中脘主腹脹不通……憂思損傷，氣積聚，腹中甚痛……中脘主大便難”；《針灸資生經(jīng)》 記載：“凡飲食不思，心腹膨脹，面色萎黃，世謂之脾腎病者，宜灸中脘”，徐靈胎曰：“募音暮，氣所結(jié)聚處”；張介賓曰：“募為臟氣結(jié)聚之所”，有學(xué)者［21］進(jìn)行了針刺中脘穴治療消化性潰瘍的多中心隨機(jī)對照試驗(yàn)研究，針刺中脘組患者的綜合療效優(yōu)于口服泰胃美組，且針刺中脘穴可快速改善胃脘疼痛及食少的癥狀，足三里是足陽明胃經(jīng)的合穴和胃腑下合穴，具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、疏風(fēng)化濕和扶正祛邪之功能；《針灸大成》 記載：足三里 “主胃中寒，心腹脹滿，腸鳴，臟氣疲憊，真氣不足，腹痛食不下，大便不通……”；《針灸甲乙經(jīng)》 記載：“五臟六腑之脹，皆取三里……水腫脹，皮腫，三里主之”。該穴主治腑病偏于通降［22］，腑 “以通為用，以降為順”。

中脘和足三里配伍屬合募配伍，合募配伍是指將六腑的下合穴與本經(jīng)的募穴配伍，因兩穴特點(diǎn)皆為治療腑病，所以合募配伍是取兩者在主治上的共性，相互協(xié)調(diào)，增強(qiáng)療效，是以治療六腑病證為主的一種配伍方法，下合穴在主治上偏于內(nèi)腑，重在通降；募穴在主治上亦偏重內(nèi)腑或陽經(jīng)的病邪。因此將合募相配，更適于治療腑病、實(shí)證、熱證。下合穴位于下肢，其位在下，與臟腑有縱向聯(lián)系；募穴位于胸腹部，其位在上，與臟腑有橫向聯(lián)系，二者相配屬上下近遠(yuǎn)配穴。一升一降，升降相合，縱橫協(xié)調(diào)，氣機(jī)通暢，陰陽相續(xù)而腑病可除。有學(xué)者［23］觀察針刺治療幽門螺旋桿菌療效，對38 例患者進(jìn)行合募配伍（中脘+足三里） 法針刺治療，取得了滿意的療效。

束縛-浸水應(yīng)激動(dòng)物模型是在眾多非損傷應(yīng)激性潰瘍動(dòng)物模型制作方法中應(yīng)用最廣泛的造膜方法，是國際上公認(rèn)的應(yīng)激性胃潰瘍造模方法。應(yīng)激性胃潰瘍是指在嚴(yán)重創(chuàng)傷，各種手術(shù)、燒燙傷、感染和敗血癥等應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生的急性胃黏膜病變，特征為淺表性、糜爛炎性潰瘍及出血［24］。該模型的制備需要從身體、心理、神經(jīng)、情緒和精神等方面產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激，與臨床上患者的發(fā)病原因十分相似［25］。情緒變化對胃黏膜與消化系統(tǒng)的影響度極高，可激發(fā)胃潰瘍癥狀的發(fā)生或加重，當(dāng)機(jī)體、軀體或心理處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸），增加胃動(dòng)素的分泌［26］，而胃動(dòng)素的分泌也促進(jìn)了酸性胃液的分泌，即引起消化道黏膜糜爛和潰瘍。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫髲娜庋坌螒B(tài)可看到胃黏膜顏色鮮紅，有明顯潰瘍灶及大面積的出血點(diǎn)，觀察HE 染色后的組織病理學(xué)，可見大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)被破壞，數(shù)量變異，腺體形狀變異且排序紊亂，炎性細(xì)胞浸潤存在于細(xì)胞間隙，由此確定本實(shí)驗(yàn)的束縛-浸水應(yīng)激法制作應(yīng)激性胃潰瘍大鼠模型制備成功。

EGFR 是上皮生長因子（epidermal growth factor， EGF） 的受體， 是表皮生長因子（ErbB）家族的一種， 其作用是控制細(xì)胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［27-28］。EGFR 對 細(xì) 胞 外 配 體 結(jié) 合 區(qū) 域 的EGF 及轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子α （transforming growth factor- α，TGF-α） 的親和性較高，與EGF 和TGF-α 結(jié)合后，EGFR 被激活，激活的受體復(fù)合體刺激細(xì)胞膜內(nèi)的ras 蛋白， 激活一系列絲裂原激活蛋白（mitogen activating protein， MAP） 激 酶 級 聯(lián) 反 應(yīng)， 激 活P13K、MAPK 和Src 及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些信號通路控制細(xì)胞的增生、分化和生存［29］。大量研 究［30-31］表 明：EGFR 的 表 達(dá) 與 胃 黏 膜 的 修 復(fù) 存在關(guān)聯(lián)，即EGFR 與可自發(fā)磷酸化的配體結(jié)合起來，促進(jìn)多條下游信號通路的激活及通路上相關(guān)蛋白的分泌，可修復(fù)受損胃黏膜，治療胃潰瘍。

本研究結(jié)果表明：電針可促進(jìn)EGFR 的表達(dá)，并推測可能基于此促進(jìn)了胃黏膜細(xì)胞增生、分化和生存，且合募配伍治療效果最佳，為電針合募配伍促進(jìn)胃黏膜修復(fù)以及胃潰瘍的治療提供了生物學(xué)依據(jù)。