張 穎，李 軼 綜述，郭 思,2△ 審校

1.河南大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南鄭州 450003;2.華中阜外醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南鄭州 450003

1882年，肺炎克雷伯菌(KP)首次從死于肺炎的患者的肺中被分離出來(lái)[1]。 KP屬于腸桿菌科，是人類胃腸道菌群的一部分。它們攜帶多種毒力基因，并且具有獲得抗菌藥物抗性基因的能力，同時(shí)可以引起局部和播散性感染[2],是臨床常見(jiàn)的條件致病菌之一。大多數(shù)“經(jīng)典”肺炎克雷伯菌(cKP)能夠引起肺炎、尿路感染、腹腔感染、血管內(nèi)裝置感染、手術(shù)部位感染、軟組織感染、菌血癥等，常發(fā)生于住院需長(zhǎng)期護(hù)理或免疫功能低下的患者，一般常規(guī)用β-內(nèi)酰胺類和其他有效對(duì)抗腸桿菌科的抗菌藥物進(jìn)行治療[3]。臨床變異的高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)在過(guò)去20年中逐漸出現(xiàn)[4]。與cKP不同，hvKP所致感染常發(fā)生在健康的流動(dòng)性人群中，通常引起社區(qū)獲得性感染，并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散，嚴(yán)重者可危及生命。除此之外，hvKP感染的肝膿腫患者通常無(wú)肝膽病史[5]。目前，尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)定義hvKP，對(duì)hvKP的鑒定大部分通過(guò)拉絲試驗(yàn)，在瓊脂平板上培養(yǎng)的菌落過(guò)夜后，用接種環(huán)輕觸菌落，若有黏液絲且拉絲長(zhǎng)度>5 mm，即可初步判斷為hvKP。hvKP的高黏性特征與其毒力有密切的關(guān)系，因而被認(rèn)為是鑒定hvKP的有效指標(biāo)。但是也有研究發(fā)現(xiàn)不是所有的hvKP菌株都表現(xiàn)為高黏性特征[5]。控制細(xì)菌莢膜多糖(cps)合成的基因可在不同菌株間通過(guò)水平傳遞的方式轉(zhuǎn)移，使不具備hvKP特征的菌株也表現(xiàn)出高黏性特征，這使得hvKP與細(xì)菌菌落高黏性特征間的相關(guān)性大大降低。因此，不能僅憑高黏性特征和血清型鑒定hvKP，而應(yīng)明確菌株的表型和基因型特性是否符合hvKP的特性以鑒定菌株的毒力[6]。本研究就hvKP的毒力相關(guān)因子及分子致病機(jī)制進(jìn)行了綜述。

1 hvKP的毒力相關(guān)因子

hvKP的高毒力與多種毒力因子密切相關(guān)，例如鐵載體、莢膜血清型、菌毛等。其中cps的合成增加與攝取鐵能力的增強(qiáng)共同組成hvKP毒力增強(qiáng)的主要因素[7]。

1.1鐵載體 鐵是一種對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)至關(guān)重要的元素，獲取鐵的能力對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和復(fù)制尤為重要。這種特性在感染過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1]。KP必須從宿主獲取鐵，以便在哺乳動(dòng)物感染期間存活和繁殖。許多病原體(包括KP)獲取鐵的主要方法是通過(guò)鐵載體的分泌，鐵載體比宿主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)鐵有更高的親和力，可以從宿主鐵螯合蛋白中獲取鐵元素或從環(huán)境中清除鐵[8-9]。另外，鐵載體的分泌也誘導(dǎo)炎癥和細(xì)菌傳播。KP可分泌多種類型的鐵載體，包括氣桿菌素、腸桿菌素、沙門(mén)菌素和耶爾森桿菌素。不同鐵載體的產(chǎn)生可以使KP定植并傳播到宿主內(nèi)的不同位點(diǎn)，在加入人類腹水的培養(yǎng)基或貧鐵的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng) hvKP和cKP，通過(guò)鐵載體定量試驗(yàn)(CAS檢測(cè)法)測(cè)得hvKP可分泌數(shù)量更多、活性更強(qiáng)的鐵載體，這可能是KP毒力增強(qiáng)的重要機(jī)制之一[7]。研究還發(fā)現(xiàn)hvKP菌株的鐵載體活性為cKP菌株的6～10倍[7]。腸桿菌素在cKP和hvKP菌株中幾乎無(wú)處不在，被認(rèn)為是KP的主要鐵攝取系統(tǒng)，相比之下，耶爾森桿菌素、沙門(mén)菌素和氣桿菌素的表達(dá)水平在hvKP中比在cKP中高得多[8]。RUSSO等[10]通過(guò)使野生型hvKP(hvKP1)基因位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在體內(nèi)及體外培養(yǎng)都不能單獨(dú)合成沙門(mén)菌素、耶爾森桿菌素、腸桿菌素，都不能使hvKP的毒力減低，而不能合成氣桿菌素的菌株毒力會(huì)明顯下降，因此氣桿菌素被認(rèn)為是hvKP最重要的鐵載體，也是其重要的毒力因子。目前氣桿菌素的水平在hvKP中明顯增多的機(jī)制尚不清楚，但已經(jīng)確定的是，在鐵缺乏的條件下，hvKP鐵載體總含量得以增加的主要原因是氣桿菌素的存在[11]。另外，耶爾森桿菌素的分泌和利用也與患者的呼吸道感染有關(guān)，hvKP強(qiáng)大的鐵攝取系統(tǒng)使得細(xì)菌在缺乏鐵的情況下也能保證足夠的鐵來(lái)源。

1.2cps

1.2.1莢膜 臨床資料表明，具有高黏性特征的KP菌株更易引起一些特殊的侵襲性感染，例如肝膿腫、腦膜炎、膿胸、眼內(nèi)炎等，高黏性特征在這些菌株引起感染的過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用[6]。hvKP的高黏液性和高毒力特征與其增厚的莢膜有關(guān)。莢膜是一種包裹細(xì)菌的細(xì)胞外多糖基質(zhì)，是細(xì)菌的一種特殊結(jié)構(gòu)。莢膜的結(jié)構(gòu)與細(xì)菌的黏附、抗血清殺菌、抗吞噬和遠(yuǎn)處定植的特性密切相關(guān)[12]。hvKP菌落黏稠的性狀正是cps合成旺盛的直接表現(xiàn)。cps由位于染色體上的cps基因簇編碼,cps基因簇全長(zhǎng)21～30 kb，包括16～25個(gè)基因。cps基因簇中wzi、wza、wzb、wzc、gnd、wca、cpsB、cpsG、galF與cps合成相關(guān)，wzy(orf4)、cpsB、cpsG與cps聚合相關(guān)，wza、wzc、orf5、orf6與裝配相關(guān),wzi編碼莢膜黏附相關(guān)的表面蛋白[13]。有研究者用分離自患肝膿腫小鼠的KP制成一系列濃度梯度的菌液，注入小鼠體內(nèi)，以半數(shù)致死量(LD50)評(píng)估菌株的毒力，結(jié)果顯示K1型野生型菌株LD50(<10 CFU)遠(yuǎn)小于不產(chǎn)莢膜的K1型突變株LD50(>1×106CFU)，以此證實(shí)了cps的毒力作用[14]。

1.2.2血清型 根據(jù)cps的不同，KP被分為82種血清型[15]，hvKP菌株由于擴(kuò)增莢膜物質(zhì)的產(chǎn)生，產(chǎn)生更加堅(jiān)固的莢膜，其中K1和K2血清型與細(xì)菌的高毒力密切相關(guān)，是導(dǎo)致臨床細(xì)菌性肝膿腫的主要致病菌。K1型常繼發(fā)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。最近有研究表明K1、K2、K5、K6、K20、K54、K57及新發(fā)現(xiàn)的 KN1血清型與hvKP有關(guān)[12]。LIU等[16]對(duì)北京朝陽(yáng)醫(yī)院2008-2012年檢測(cè)出的hvKP進(jìn)行PCR及多位點(diǎn)基因分析，發(fā)現(xiàn)hvKP莢膜分型中常見(jiàn)的是K1、K2、K20和K57，并且hvKP陽(yáng)性患者更易發(fā)生社區(qū)獲得性感染，且多集中于K1及K2型。有研究對(duì)2013-2014年北京3家教學(xué)醫(yī)院肝膿腫病例進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)引起肝膿腫的hvKP以K1型為主(53.9%)，其次為K2型(32.2%)[13]。那么，為什么K1和K2血清型在hvKP中如此普遍？主要有以下幾個(gè)原因：(1)K1和K2菌株缺乏被宿主因子識(shí)別的特定甘露糖殘基重復(fù)序列，例如巨噬細(xì)胞上的甘露糖結(jié)合受體和肺分泌的表面活性蛋白A(SP-A)；(2)K1和K2菌株表面具有宿主特異性單糖唾液酸，可模擬宿主細(xì)胞，從而可逃避宿主免疫細(xì)胞；(3)與其他血清型菌株相比，K1和K2菌株可誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞釋放更小的活性氧物質(zhì)，從而可以更好地存活于人體組織中；(4)與具有其他K血清型的菌株相比，K1和K2菌株具有更多樣的O血清型，其可以幫助K1和K2菌株逃避宿主免疫系統(tǒng)。K1及K2型莢膜最初被認(rèn)為是hvKP的主要毒力因子，也被定義為hvKP最初的主要特征。但是，并非所有的hvKP引起的社區(qū)獲得性肝膿腫都是K1及K2型，在非社區(qū)性獲得性肝膿腫的小鼠模型中也檢測(cè)出K1、K2型，并且表現(xiàn)出較低的毒性[10]。TAN等[17]對(duì)129株分離出的hvKP進(jìn)行PCR測(cè)定，發(fā)現(xiàn)超過(guò)一半和肝膿腫有關(guān)的血清型不是K1及K2型。所以，hvKP的毒力強(qiáng)弱并非僅僅是K1、K2莢膜血清型分型導(dǎo)致的，可能與其毒力基因有關(guān)。

1.2.3高黏性表型 參與調(diào)控胞外cps合成的主要莢膜轉(zhuǎn)錄激活因子有RmpA及RmpA2。目前認(rèn)為位于染色體上的c-rmpA基因和質(zhì)粒上的p-rmpA、p-rmpA2基因在hvKP中參與編碼RmpA、RmpA2[18]。

RmpA可激活莢膜產(chǎn)生，導(dǎo)致高黏液表型和毒力增加。在KPCG43中，p-rmpA和p-rmpA2均有助于增加莢膜產(chǎn)生，而在NTUH-K2044(ST23、K1血清型)中，第一個(gè)基因組測(cè)序的hvKP，只有p-rmpA促成莢膜基因表達(dá)的增加。因此，說(shuō)明每種RmpA在超毒力中的作用也是十分必要的。最近，吳桂立[19]在臨沂地區(qū)hvKP的分子致病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，69株KP中具有高黏液表型的hvKP為37株，其中收集的 hvKP 菌株全部表達(dá)RmpA，因此，RmpA可以作為實(shí)驗(yàn)室診斷hvKP的輔助參考指標(biāo)。此外，有研究表明，RmpA以RcsB依賴性方式激活cps表達(dá)，并且其DNA結(jié)合基因序列是發(fā)揮調(diào)節(jié)作用所必需的[20]。

黏液相關(guān)基因A(magA)于2004年被發(fā)現(xiàn)，magA存在于Kl型KP的cps體生物合成區(qū)內(nèi)，被認(rèn)為與細(xì)菌高黏性、血清抵抗及細(xì)胞吞噬抗性有關(guān)，作為KP cps聚合酶wzy負(fù)責(zé)K抗原的合成，現(xiàn)將magA重命名為wzykDk。臺(tái)灣的一項(xiàng)研究顯示，83%來(lái)自化膿性肝膿腫患者的KP菌株為magA陽(yáng)性，從其他侵襲性感染患者中分離的菌株中只有3%為magA陽(yáng)性[15]。但是，最近有研究發(fā)現(xiàn)，許多高黏性KP菌株并未檢測(cè)出magA基因，一些表達(dá)magA的菌株也并未表現(xiàn)出高黏性特征，表明magA基因與高黏性特征兩者之間可能并沒(méi)有特定的聯(lián)系[6]。在對(duì)77株已明確血清型的KP菌株的研究中發(fā)現(xiàn)，magA僅存在于K1血清型的菌株中，因此，認(rèn)為magA基因是編碼K1血清型菌株cps的主要基因，而非特定的毒力基因，即magA基因是一個(gè)編碼KP的莢膜血清型而非高黏性特征的cps基因[6]，在K1血清型KP中是重要的毒力因子，與其致病性有很大的聯(lián)系。

1.3菌毛 細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面是其進(jìn)展至感染的關(guān)鍵步驟之一，在KP中，這通常通過(guò)菌毛來(lái)實(shí)現(xiàn)[3]。目前，已知兩種類型的菌毛存在于KP中，即1型和3型菌毛。雖然已知3型菌毛能與氣管上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞等不同人類細(xì)胞結(jié)合，但1型菌毛似乎更具有特異性。另外，KP菌株產(chǎn)生生物膜的能力增強(qiáng)導(dǎo)致KP對(duì)宿主防御因子和抗微生物劑的抗性增加，并且生物膜越來(lái)越多地被認(rèn)為是重要的毒力因子。影響生物膜形成的因素有很多，如莢膜、菌毛、數(shù)量感知系統(tǒng)等，其中菌毛在生物膜的形成過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[21]。而1型和3型菌毛也與KP中的生物膜形成有關(guān)(3型菌毛比1型菌毛作用更強(qiáng))[22]。hvKP比cKP產(chǎn)生更多的生物膜，這可能也是其毒力增強(qiáng)的原因之一。

1.4序列類型 序列分型是用于菌株分類的分子流行病學(xué)方法，并且已經(jīng)用于KP的分型篩選[1]。hvKP菌株具有特定的MLST序列型別，如ST23與Kl莢膜血清型和肝膿腫密切相關(guān)，另外，ST57與K1型相關(guān)，ST86、ST375、ST380與K2型相關(guān)。常見(jiàn)的cKP序列分型為ST11、ST15、ST65和ST258，另外，K1/ST23更可能含有與高黏液表型和鐵攝取相關(guān)的毒力基因，與這些毒力基因共同促成hvKP的發(fā)病機(jī)制。與K1血清型相比，K2和其他血清型在ST方面遺傳多樣性差異更大，并且獲得毒力基因(kfu、irp、iuc、iro、rmpA)的可能性較小[2]。雖然hvKP的序列分型與其高毒力及致病性沒(méi)有直接的關(guān)系，但是對(duì)可能引起感染流行的hvKP進(jìn)行序列分型有助于早期干預(yù)[23]。

2 hvKP的定植與感染

hvKP的定植是獲得內(nèi)源性感染的第一步，但是hvKP定植感染發(fā)病率及感染機(jī)制并不明確。hvKP在胃腸道、口咽、皮膚均可定植，但是胃腸道是定植的主要部位。細(xì)菌進(jìn)入到腸道以外的組織或器官以繼續(xù)生長(zhǎng)是整個(gè)感染的重要步驟，cKP和其他腸桿菌科感染的途徑包括從會(huì)陰部進(jìn)入膀胱，破壞腸道使細(xì)菌進(jìn)入腹膜腔，口咽部定植進(jìn)入呼吸道，以及破壞皮膚屏障等。雖然hvKP進(jìn)入機(jī)體的途徑并不明確，但是可以明確的是hvKP感染通常發(fā)生在宿主抵抗力無(wú)明顯缺陷的患者中。而且，hvKP進(jìn)入宿主體內(nèi)并不一定會(huì)引起感染，細(xì)菌還需要應(yīng)對(duì)宿主的抵抗力并在宿主體內(nèi)存活。研究表明hvKP菌株的存活能力明顯高于cKP菌株[24]。hvKP可以導(dǎo)致化膿性肝膿腫、脾膿腫、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肺炎、眼內(nèi)炎、腦膜炎、尿路感染等。另外，糖尿病、惡性腫瘤、肺炎、腎臟疾病被認(rèn)為是hvKP感染的高危因素。此外，hvKP感染導(dǎo)致的化膿性肝膿腫通常發(fā)生在無(wú)肝膽病史的人群中，定植在腸道的細(xì)菌通過(guò)侵犯腸黏膜進(jìn)入門(mén)靜脈，繼而到達(dá)肝臟引起感染。通過(guò)對(duì)hvKP感染的小鼠模型的研究已經(jīng)證實(shí)hvKP可以穿過(guò)腸黏膜屏障導(dǎo)致肝膿腫。此外,吞噬了hvKP的中性粒細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)可將hvKP帶至機(jī)體的多個(gè)部位,導(dǎo)致皮下組織、肺、肝形成膿腫[5]。另外，hvKP感染存在一定的區(qū)域易感性，在亞洲人群中高發(fā)，這可能與宿主基因易感性或不同地域病原體暴露水平不同有關(guān)。

3 小 結(jié)

目前對(duì)hvKP的研究有限，鐵載體、莢膜血清型、高黏液表型、菌毛等被認(rèn)為是hvKP的高毒力因子，并與其致病能力有關(guān)。但目前對(duì)其分子致病機(jī)制尚無(wú)法完全闡明，hvKP進(jìn)入機(jī)體的途徑及發(fā)生轉(zhuǎn)移性播散的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，轉(zhuǎn)移性感染為何易發(fā)生于糖尿病患者，亞裔群體中hvKP為何具有較高的腸道攜帶率，其與免疫系統(tǒng)是如何相互作用，這些問(wèn)題都亟待解決。但是，目前國(guó)內(nèi)對(duì)hvKP的研究還主要集中于hvKP的耐藥性。臨床工作者必須提高對(duì)hvKP的認(rèn)識(shí)，深入研究hvKP的致病機(jī)制對(duì)于正確認(rèn)識(shí)hvKP所致感染,降低hvKP的危害具有重要意義[25]。