■許詩(shī)亮 王士政 徐 瑞 趙雨夢(mèng) 黃璞祎

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

蛇鮈(Saurogobio dabryi)，屬鯉形目，鮈亞科，蛇鮈屬，是一種中下層小型雜食魚(yú)類(lèi)，分布廣泛，因其數(shù)量多，個(gè)體肥壯，味道鮮美而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。隨著蛇鮈消費(fèi)需求的不斷增加，蛇鮈的人工養(yǎng)殖技術(shù)開(kāi)始受到更多關(guān)注[1]。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖中一般使用配合飼料來(lái)控制成本，但配合飼料口感與天然飼料的較大差別導(dǎo)致部分魚(yú)類(lèi)攝食興趣不高、生長(zhǎng)速度受限。誘食劑作為一種非營(yíng)養(yǎng)添加劑，具有促進(jìn)攝食、提高消化率與生長(zhǎng)率的特點(diǎn)，是解決上述問(wèn)題的良好途徑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

嗅電圖是研究嗅覺(jué)反應(yīng)的重要指標(biāo)，是在嗅上皮上記錄到的一種電位變化，也是研究誘食劑效果的一種有效方法。目前國(guó)外關(guān)于嗅電圖的研究多集中于信息素與毒理學(xué)方面的研究[2-3]，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究少有報(bào)道。另外近年來(lái)對(duì)于水產(chǎn)誘食劑的研究方法多使用觸球法、迷宮法和攝食生長(zhǎng)法，嗅電圖法的相關(guān)報(bào)道也較為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)以蛇鮈為對(duì)象，采用嗅電圖法，研究目前幾種常用動(dòng)植物提取物誘食劑（搖蚊幼蟲(chóng)、蚯蚓、甘草、陳皮）對(duì)蛇鮈的誘食效果，通過(guò)研究蛇鮈嗅電變化評(píng)價(jià)誘食劑的誘食效果，為進(jìn)一步探究誘食劑作用機(jī)理和發(fā)展蛇鮈養(yǎng)殖業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

丁香酚溶液：純度99%，購(gòu)于哈爾濱本地藥店，加入蒸餾水稀釋成45 mg/l的溶液。

三碘季胺酚：取三碘季胺酚粉末加入蒸餾水稀釋成40 mg/l的溶液（上海源葉生物科技有限公司公司）。

搖蚊幼蟲(chóng)與蚯蚓提取液：新鮮搖蚊幼蟲(chóng)與蚯蚓購(gòu)于哈爾濱市道外花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)，將購(gòu)得的搖蚊幼蟲(chóng)和蚯蚓分別清洗后加入等質(zhì)量的蒸餾水后以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速勻漿3 min，之后以3 000 r/min 的速度離心5 min 取上清液，得到0.5 g/l 的搖蚊幼蟲(chóng)及蚯蚓提取液，分別稀釋為0.05、0.01、0.005 g/l 的足量溶液，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

甘草與陳皮提取液：購(gòu)于哈爾濱市本地藥店，將購(gòu)得的200 g 甘草和200 g 陳皮分別加入2 L 水在沸騰狀態(tài)下進(jìn)行煎煮30 min，倒出藥液后再加入2 L 水再次在沸騰狀態(tài)下煎煮30 min，將兩次得到的藥液合并作為濃度為0.05 g/l 的提取液，取一部分稀釋為足量0.01、0.005 g/l的溶液，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

所有試劑均為現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康野生蛇鮈30尾，2019年4月購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市松花江周邊漁民，體長(zhǎng)(15.45±1.10) cm，體重(22.32±1.40) g。飼養(yǎng)水用曝氣24 h以上的自來(lái)水，在玻璃缸中暫養(yǎng)5 d 后用于正式實(shí)驗(yàn)，每天更換1/2 的已曝氣的水，期間不投食。期間氣泵充氣，保證溶氧不低于6 mg/l。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)中主要實(shí)驗(yàn)儀器為RM6240 多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）、FSH-II型高速電動(dòng)勻漿器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）、LDZ4-2 自動(dòng)平衡離心機(jī)（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.4 EOG實(shí)驗(yàn)方法

分別將搖蚊幼蟲(chóng)提取液、蚯蚓提取液、甘草提取液和陳皮提取液稀釋為足量的0.05、0.01、0.005 g/l的溶液，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫為17 ℃。

實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)選取10尾生理狀況良好的蛇鮈個(gè)體在45 mg/l的丁香酚溶液中浸泡20 min使其麻醉至第四階段[4]。待魚(yú)體麻醉后，向其背部肌肉注射10 ml三碘季胺酚溶液將其固定。用解剖剪剪開(kāi)魚(yú)頭部左側(cè)前后鼻孔間的表皮，暴露嗅表皮。將魚(yú)體放入事先準(zhǔn)備好的玻璃缸中，保持懸空固定。將輸液器軟管放入口腔中，不斷通入去氯自來(lái)水，保持其穩(wěn)定呼吸狀態(tài)。用相同規(guī)格的銀絲作為電極，記錄電極接觸嗅表皮，參考電極接觸同側(cè)眼眶上方，魚(yú)體接地。

電極與RM6240 多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)相連記錄電位變化。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，用另一套輸液器向暴露的嗅表皮滴加誘食劑溶液或沖洗液，兩次滴加間隔5 s，流速約為0.6 ml/min。以滴加誘食劑溶液產(chǎn)生的EOG振幅作為實(shí)驗(yàn)組，去氯自來(lái)水引起的電位變化作為對(duì)照組。每種濃度的誘食劑溶液連續(xù)滴加3次后，用裝有去氯自來(lái)水的注射器沖洗嗅囊及全身約1 min，待魚(yú)體呼吸及嗅電變化狀態(tài)穩(wěn)定后開(kāi)始下一組實(shí)驗(yàn)，按照表1 所示順序進(jìn)行滴加，以減少不同誘食劑之間的干擾以及脫敏現(xiàn)象。在數(shù)據(jù)記錄過(guò)程中，同種溶液對(duì)同一個(gè)體產(chǎn)生的EOG 振幅差異超過(guò)20%的數(shù)據(jù)棄用。

振幅測(cè)量方法是取峰電位與靜息電位差值作為EOG幅值（見(jiàn)圖1）。

圖1 EOG波形

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用RM6240USB2.0z 軟件記錄EOG，通道模式設(shè)置為生物電，掃描速度200 ms/div，靈敏度5 mV，時(shí)間常數(shù)0.2 s，濾波頻率30 Hz，導(dǎo)聯(lián)關(guān)閉，低通濾波15 Hz。

以對(duì)照組EOG 幅值為100%，求其他誘食劑溶液的相對(duì)刺激效應(yīng)（相對(duì)刺激效應(yīng)=EOG幅值/對(duì)照組），實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（M±SE）表示。

利用SPSS Statistic 21 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析、相關(guān)性檢驗(yàn)與多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同誘食劑對(duì)蛇鮈誘導(dǎo)的EOG波形圖(見(jiàn)圖2)

從圖2 中可以看出，當(dāng)嗅表皮接觸刺激溶液時(shí)，首先由靜息電位迅速上升，隨后下降形成峰電位，之后繼續(xù)下降至低于靜息電位水平，最終緩慢恢復(fù)至靜息電位。不同種類(lèi)、濃度的刺激液形成的峰電位值有所不同，但形狀基本相似。

2.2 不同誘食劑對(duì)蛇鮈的誘食效果比較

圖2 誘食劑嗅電波形

相關(guān)性分析表明（見(jiàn)表1），誘食劑種類(lèi)與相對(duì)刺激效應(yīng)顯著相關(guān)（P＜0.05）。縱向比較下，搖蚊幼蟲(chóng)提取液、蚯蚓提取液、甘草提取液和陳皮提取液四種誘食劑產(chǎn)生的相對(duì)刺激效應(yīng)與濃度產(chǎn)生正相關(guān)，即濃度越高產(chǎn)生的相對(duì)刺激效應(yīng)越高；由表1 可知，橫向比較下，在濃度為0.05 g/l 和0.005 g/l 時(shí)：搖蚊幼蟲(chóng)提取液＞甘草提取液＞陳皮提取液＞蚯蚓提取液；在濃度為0.01 g/l 時(shí)：甘草提取液＞搖蚊幼蟲(chóng)提取液＞陳皮提取液＞蚯蚓提取液。由表2可知，總體而言誘食效果：搖蚊幼蟲(chóng)＞甘草＞陳皮＞蚯蚓。

表1 不同濃度的誘食劑相對(duì)刺激效應(yīng)（mV）

表2 相對(duì)刺激效應(yīng)多重比較（P值）

由表2 可知，搖蚊幼蟲(chóng)、甘草、陳皮與對(duì)照組相比，誘食效果極顯著（P＜0.01）；蚯蚓與搖蚊幼蟲(chóng)相比，誘食效果差異極顯著（P＜0.01），與甘草相比，誘食效果差異顯著（P＜0.05）；蚯蚓誘食效果與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 嗅電圖分析

目前關(guān)于魚(yú)類(lèi)誘食劑的研究中，主要的研究方法有攝食生長(zhǎng)法、行為學(xué)法、電生理法等。攝食生長(zhǎng)法是以魚(yú)的攝食量為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)誘食效果。攝食生長(zhǎng)法需要的實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不適用于誘食劑的篩選。行為學(xué)法包括觸球法、迷宮法等。觸球法相對(duì)客觀,但無(wú)法確定魚(yú)類(lèi)的啄咬行為是攝食行為還是攻擊行為;迷宮法裝置過(guò)于復(fù)雜, 不利于大量應(yīng)用;本實(shí)驗(yàn)采用的方法是電生理法中的嗅電圖分析。嗅電圖已被證明是研究魚(yú)類(lèi)對(duì)刺激物嗅覺(jué)敏感程度的有效方法[5]，與其他誘食劑研究方法相比，這種方法裝置簡(jiǎn)便且受到魚(yú)類(lèi)行為和生理狀態(tài)差異的干擾較小，可以廣泛應(yīng)用于誘食劑的研究之中。

在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)刺激物接觸蛇鮈嗅囊時(shí)可以記錄到清晰完整的波形，且不同刺激物形成的波形基本相同。但本實(shí)驗(yàn)中的波形與其他學(xué)者測(cè)量到的波形不同，在梁春梅等[6]對(duì)羅非魚(yú)嗅囊對(duì)生物活性肽的EOG反應(yīng)的報(bào)道中，EOG 波形被描述為單相負(fù)電位，滴加刺激時(shí)，EOG 先快速上升隨后緩慢恢復(fù)至基線位置。作者認(rèn)為此處差異與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正負(fù)電極的連接差異有關(guān)，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。

3.2 不同誘食劑對(duì)蛇鮈的誘食效果

魚(yú)類(lèi)攝食過(guò)程一般可以分為四個(gè)步驟，即啟動(dòng)階段、搜索階段、鑒定階段和攝入階段。在不同階段魚(yú)類(lèi)所依賴的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有所不同：①啟動(dòng)階段，魚(yú)類(lèi)主要依靠視覺(jué)識(shí)別和嗅覺(jué)感受氣味分子來(lái)發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)距離的食物，從而發(fā)覺(jué)食物的存在；②搜索階段，依靠視覺(jué)和嗅覺(jué)的引導(dǎo)，魚(yú)類(lèi)開(kāi)始朝著食物方向運(yùn)動(dòng)；③鑒定階段，主要依靠味覺(jué)對(duì)食物進(jìn)行接觸識(shí)別；④攝入階段，在確認(rèn)食物可以攝入之后，魚(yú)類(lèi)開(kāi)始不斷攝入食物直至飽食[7]。水產(chǎn)誘食劑通過(guò)顏色、形狀、氣味、口味等不同方面給予魚(yú)類(lèi)嗅覺(jué)和味覺(jué)的物理或化學(xué)刺激，從而吸引魚(yú)類(lèi)攝食[8-9]。 大量研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)對(duì)食物的選擇主要取決于該種食物對(duì)其感覺(jué)器官的刺激強(qiáng)度大小以及遺傳或記憶產(chǎn)生的偏好等[10]。這種偏好可以通過(guò)食性分析進(jìn)行研究。

3.2.1 搖蚊幼蟲(chóng)和蚯蚓對(duì)蛇鮈的誘食效果

對(duì)嘉陵江蛇鮈的食性分析顯示[11]，環(huán)節(jié)動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物和藻類(lèi)等是蛇鮈的偏好食物，這與本實(shí)驗(yàn)中搖蚊幼蟲(chóng)的顯著誘食效果是一致的。在國(guó)內(nèi)其他相關(guān)研究中可知，水產(chǎn)動(dòng)物攝食引誘物質(zhì)主要是氨基酸類(lèi)、生物堿和核苷酸等物質(zhì)[12-13]。在本實(shí)驗(yàn)中蚯蚓并未體現(xiàn)出顯著誘食效果，可能是由于蚯蚓種類(lèi)不同而在成分上有所差異，或蛇鮈因生活地域不同而對(duì)食物偏好有所不同導(dǎo)致。

3.2.2 陳皮和甘草對(duì)蛇鮈的誘食效果

中草藥是我國(guó)具有優(yōu)勢(shì)的特色資源，具有天然、來(lái)源廣泛、副作用小、成本相對(duì)較低等特點(diǎn)。1996 年梁思析等[14]歸納了日本學(xué)者對(duì)中草藥作為水產(chǎn)誘食劑的有效嘗試，認(rèn)為中草藥是一種具有廣闊前景的誘食劑原料。我國(guó)學(xué)者對(duì)中草藥誘食劑開(kāi)展了大量的研究，發(fā)現(xiàn)中草藥具有促進(jìn)魚(yú)類(lèi)攝食、提高生長(zhǎng)率、降低餌料系數(shù)的功能。其他學(xué)者通過(guò)攝食生長(zhǎng)法、觸球法、迷宮法的研究，證實(shí)陳皮、甘草、大蒜、洋蔥、黃柏、丁香等中草藥已被證實(shí)對(duì)魚(yú)類(lèi)有顯著的誘食效果，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本一致[15-16]。同時(shí)，徐俊杰等[17]發(fā)現(xiàn)甘草對(duì)鯽魚(yú)有抑制攝食作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，可能與鯽魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育階段有關(guān)，也可能與魚(yú)類(lèi)種間差異、食性差異有關(guān)。

韓妍妍等[18]曾提出，中草藥中含有的氨基酸、生物堿等物質(zhì)可能是使其具有誘食作用的關(guān)鍵。已有學(xué)者通過(guò)化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，甘草主要活性成分是二氫茋類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物[19]，陳皮主要活性成分是生物堿類(lèi)、檸檬苦素、黃酮類(lèi)[20]。這些成分除了刺激魚(yú)類(lèi)嗅覺(jué)外，還具有一定的抗氧化、抗菌和抗癌活性等，可能在改善魚(yú)體健康方面有一定功效。今后可對(duì)其主要活性成分進(jìn)行研究，可能會(huì)為未來(lái)的誘食劑與飼料添加劑開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

另外，中草藥誘食劑的處理方式多樣，本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)煎煮的方法獲取提取液，與陳思航等[21]的方法一致；有學(xué)者將中草藥原料粉碎后進(jìn)行勻漿，過(guò)濾后使用；也有學(xué)者將中草藥原料直接超微粉碎后添加到飼料中用于生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)[22]。不同處理方法可能會(huì)對(duì)結(jié)果有一定的影響。

4 結(jié)論

通過(guò)EOG法分別測(cè)定了0.05、0.01、0.005 g/l的搖蚊幼蟲(chóng)提取液、蚯蚓提取液、甘草提取液和陳皮提取液對(duì)蛇鮈的誘食效果，結(jié)果顯示：①誘食劑的種類(lèi)與濃度均對(duì)相對(duì)刺激效應(yīng)有顯著影響；②搖蚊幼蟲(chóng)、甘草和陳皮均對(duì)蛇鮈有顯著誘食效果，搖蚊幼蟲(chóng)誘食效果最好，最佳濃度為0.05 g/l。建議將搖蚊幼蟲(chóng)、甘草和陳皮作為蛇鮈的誘食劑使用，但是三者混合使用效果仍需進(jìn)一步的研究。不建議將蚯蚓作為蛇鮈的誘食劑使用。