況慧娟，劉世宇，金 巖

（第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院/軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室/口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心/陜西省口腔疾病國際聯合研究中心，西安710032）

骨缺損是骨結構完整性受到破壞的骨科常見疾病，創(chuàng)傷、感染、腫瘤等是導致骨缺損的主要原因[1]。目前臨床治療骨缺損的方法主要通過自體骨移植或異體骨移植，但自體骨移植存在來源有限等缺陷，而異體骨移植也因感染或排斥等因素而導致并發(fā)癥的出現[2]。因此，如何促進骨缺損組織的再生修復是亟待解決的問題。近年來，細胞移植和生物材料在骨組織再生中發(fā)揮重要作用，但細胞移植存在一定的潛在風險，如引起血栓或其他并發(fā)癥等問題[3]，而生物材料的安全性和有效性也有待進一步考量[4]。因此，越來越多的研究轉向同樣具有組織修復功能的外泌體（exosomes）。外泌體是一類由細胞分泌的膜性微型囊泡，參與細胞間通訊并調控靶細胞的生物學功能[5]，可調控骨再生中相關細胞的活性，有望成為解決骨再生的潛在治療方法。本文主要圍繞外泌體在骨再生領域的應用進行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的形成和來源 外泌體是由多胞體（multivesicular body，MVB）與細胞膜融合后由細胞主動分泌到細胞外，直徑為30～100 nm 的胞外囊泡。當MVB 內陷形成內囊泡時，由ESCRTs 蛋白組成的復雜蛋白網絡結構可促進MVB 形成和囊泡出芽，同時將一些特定的蛋白納入到內囊泡內[6]。此外，跨膜蛋白也參與外泌體的生物形成和其中蛋白質的負載。研究表明，細胞內四跨膜蛋白的微區(qū)可與ESCRTs 作用促進內囊泡的形成[7]，并與CD81 相互作用將蛋白質分選至外泌體內[8]。最近研究揭示了另一種ESCRT 途徑，即syndecan-syntenin-ALIX 途徑。由于ALIX 結合幾種ESCRT 蛋白，因此Syntenin 與ALIX 相互作用促進內囊泡的形成，隨之在硫酸乙酰肝素調控下促進內囊泡的出芽，并將syntenin-1、syndecan 和CD63 蛋白分選至外泌體內[9]。除ESCRTs 途徑外，有研究表明脂質在外泌體的形成過程中也發(fā)揮重要作用。在外泌體的膜結構中富含鞘磷脂酶，后者水解形成神經酰胺，促進內囊泡的出芽[6]。T 細胞、內皮細胞、樹突細胞、巨噬細胞、間充質干細胞等幾乎所有的活細胞都能分泌外泌體，在血液、尿液、唾液中都能檢測到外泌體。

1.2 外泌體組成 外泌體中含有蛋白質、核酸、脂質等多種成分，但其組成與細胞類型、細胞生理狀態(tài)以及囊泡的生物形成方式有關。蛋白組學表明，外泌體內含有四跨膜蛋白（CD63、CD81、CD9）、參與免疫應答的抗原呈遞蛋白（MHCI 和 MHCII）[10]、參與膜轉運和融合蛋白（GTPases、Annexins、flotillin）以及熱休克蛋白（Hsp70 和 Hsp90）[11]，這些蛋白也常用于外泌體的鑒定。除蛋白質外，外泌體還含有多種核酸遺傳物質。少數細胞如星形膠質細胞和膠質母細胞瘤細胞來源的外泌體含有線粒體DNA[12]。除DNA 外，外泌體還富含 mRNA、miRNA、tRNA、rRNA 等小 RNA。研究表明，miRNA 是外泌體參與細胞信號傳遞和細胞間交流的主要生物活性物質。miRNA 是一類非編碼的小RNA，與其靶向分子一同調控生物體的生理活動。囊泡內miRNA 比游離miRNA 具有更長的半衰期和較高的穩(wěn)定性，因此miRNA 在外泌體脂質雙分子層的保護下，能更好發(fā)揮對靶細胞的調節(jié)作用[13]。由于miRNA 在外泌體內的穩(wěn)定性，可作為某些疾病的診斷標志物。外泌體的雙層膜結構還富含膽固醇、甘油二酸酯、甘油磷脂、磷脂和鞘脂或糖基神經酰胺（包括鞘磷脂和神經酰胺）等脂質分子[14]。除了維持外泌體的穩(wěn)定性，脂質也可作為某些疾病如前列腺癌的生物診斷標志物[15]。

1.3 外泌體的釋放 與外泌體形成機制類似，外泌體釋放也存在多種機制。眾多研究表明，Rab 家族在調控外泌體釋放中起著重要作用。將過表達Rab11突變體轉染至白血病K562 細胞中，可抑制細胞外泌體的釋放[16]。抑制 Rab2b、Rab5a、Rab9a、Rab27a 和Rab27b 蛋白表達后，Hela 細胞外泌體的分泌量大量減少，其中Rab27a 和Rab27b 的缺失效應更明顯[17]。除了Rab 蛋白家族，SNARE 蛋白也是外泌體釋放中另一個重要調控分子。在腎HEK293 細胞中，SNARE蛋白 YKT6 可通過 TSG101、WNT3A 和 VPS26/35 調控外泌體釋放[18]。此外，突觸蛋白也可影響MVB 與細胞質膜的融合[19]。細胞內存在多種調控外泌體分泌的效應分子，更深入研究其機制有助于對外泌體的全面認識。

1.4 靶細胞對外泌體攝取方式 外泌體能識別靶細胞并被靶細胞攝取是其發(fā)揮調控作用的前提。外泌體被靶細胞攝取的可能機制之一是外泌體的膜與靶細胞的細胞質膜直接融合[20]，外泌體膜上的類脂筏狀膜有助于與細胞膜融合[21]。第二種可能的攝取機制是內吞作用，內吞作用分為網格蛋白介導的內吞作用、小窩蛋白介導的內吞作用、脂質筏介導的內吞作用、巨胞飲作用和吞噬作用。根據受體細胞類型，外泌體的攝取機制不同。腫瘤細胞來源的外泌體通過網格蛋白介導的內吞作用和巨胞飲作用被骨髓間充質干細胞攝取[22]。B 淋巴細胞對外泌體的攝取主要是依賴膽固醇介導[23]。血管內皮細胞攝取外泌體主要由小窩蛋白發(fā)揮作用[24]。細胞攝取外泌體的第三種可能機制是通過特定受體-配體相互作用介導。有研究發(fā)現，白細胞亞群對胰腺癌細胞外泌體攝取的差異取決于白細胞粘附分子，腹膜滲出細胞對外泌體的攝取量最多，淋巴細胞和粒細胞次之[25]。牛奶來源的外泌體表面MUC1 蛋白可與樹突細胞DCSIGN 蛋白特異性結合，從而被樹突細胞吞噬。但血清來源的外泌體不存在MUC1 蛋白或其他可能與DC-SIGN 蛋白結合的糖蛋白，因此無法被樹突細胞吞噬[26]。

2 外泌體在骨再生中的作用

2.1 外泌體與血管生成 骨是高度血管化的組織，依賴血管和骨細胞的緊密聯系來維持骨的完整性，血管生成在骨再生中起重要作用。研究發(fā)現，內皮祖細胞外泌體通過傳遞miR-126 促進內皮細胞的增殖、遷移和血管生成能力，提高大鼠脛骨周圍的血管密度，從而有效加快骨缺損中骨再生進程[27]。對股骨骨折大鼠注射間充質細胞來源外泌體，可促進內皮細胞增殖、遷移、管腔形成和血管生成，加快骨折愈合。進一步研究顯示，外泌體通過誘導HIF-1α 促進血管內皮生長因子（VEGF）的表達，從而促進骨再生[28]。此外，星形膠質細胞外泌體含有多種抗血管生成的成分如內皮抑素等，可有效抑制新生血管的生成[29]。另一項研究證實，外泌體可通過miR-9 抑制其靶基因MDK 表達，并同時調控PDK/AKT 信號通路來抑制內皮細胞的遷移和增殖，從而抑制新生血管的生成[30]。因此，外泌體來源的選擇以及如何提高外泌體促進血管生成的能力尤為關鍵。研究表明，缺氧條件可調控外泌體內生物活性物質的表達，從而在不同微環(huán)境中促進血管生成。慢性缺氧條件下多發(fā)性骨髓瘤細胞分泌的外泌體內miR-135b 高度表達，而miR-135b 可靶向內皮細胞內FIH-1/HIF-1信號通路，從而加速血管生成[31]。缺氧預處理后，間充質干細胞外泌體可增加促血管生成、增殖和遷移的miR-126 的表達，從而促進骨折愈合進程[32]。除缺氧外，生物材料也可提高外泌體的促血管生成能力。一種含鋰生物材料可誘導外泌體內miR-130a 表達，隨之激活PTEN/AKT 信號通路，最終促進骨骼再生中的血管生成[33]。綜上所述，外泌體與骨組織再生血管形成有關，恰當選擇外泌體來源及調控外泌體內生物活性物質的表達，有望成為促進骨再生的有效治療手段。

2.2 外泌體與成骨細胞 骨的生長發(fā)育和再生與成骨細胞密切相關。成骨細胞由骨髓間充質干細胞分化而來，負責骨的形成、重塑和愈合。成骨細胞的增殖、分化受激素、蛋白質、miRNA 等因素的調控，而外泌體可調節(jié)成骨細胞的增殖分化來促進骨再生。骨髓間充質干細胞來源的外泌體通過攜帶miR-122-5p 激活MAPK 信號，提高受體酪氨酸激酶活性，促進成骨細胞的增殖和分化，從而改善骨質疏松缺損的骨再生[34]。間充質干細胞外泌體可增強成骨細胞內成骨基因的表達和堿性磷酸酶活性，促進大鼠顱骨缺損的骨再生[35]。經骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）刺激后，巨噬細胞外泌體可明顯增大成骨細胞內成骨分化標志物ALP 和BMP2 表達，從而通過增加成骨細胞的增殖分化來促進骨再生[36]。當TNF-α 預處理脂肪組織3 天后，脂肪組織外泌體內Wnt-3a 蛋白上調，可顯著增強人初代成骨細胞的增殖和成骨分化能力，從而促進骨修復和骨再生[37]。此外，成骨細胞外泌體也具有促進骨形成的潛在機制。骨髓基質細胞吞噬礦化成骨細胞外泌體后，細胞內91 種miRNA 表達上調，182 種miRNA 表達下調。進一步研究發(fā)現，礦化成骨細胞外泌體通過miR-667-3p、miR -6769b -5p、miR -7044 -5p、miR -7668 -3p 和miR-874-3p 共同靶向Axin1 基因，隨之促進βcatenin 表達并激活Wnt 信號通路，導致骨髓基質細胞向成骨細胞分化，增強成骨作用[38]。成熟成骨細胞外泌體可激活內皮細胞VEGF/Erk1/2 信號通路，增強內皮細胞增殖、遷移和血管生成，間接促進骨再生[39]。對成骨細胞外泌體進行蛋白組學分析，發(fā)現其中786 種蛋白質參與直核起始因子2 通路、mTOR通路等成骨通路，因而具有成骨潛能[40]。對小鼠Mc3t3細胞外泌體進行蛋白組學分析，在鑒定的1 536 種蛋白質中有172 種蛋白質與骨骼數據庫重疊，蛋白網絡分析顯示外泌體內的蛋白質與骨骼肌系統(tǒng)的發(fā)育和功能、發(fā)育障礙、遺傳性障礙和成骨途徑相關，并且 EFNB1、轉化生長因子 β 受體 3、LRP6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1 型和SMURF1 在成骨中發(fā)揮重要作用[41]，提示成骨細胞來源的外泌體內蛋白質可為骨形成研究提供新的前景。綜上，外泌體及其蛋白質和miRNA 可增強成骨的信號分子，從而發(fā)揮促進骨再生、修復骨缺損的作用。

2.3 外泌體與破骨細胞 破骨細胞是來源于單核細胞的多核細胞，可通過分泌蛋白酶及酸性物質降解骨基質[42]。破骨細胞與成骨細胞功能相對，在骨再生中發(fā)揮重要作用。破骨細胞分化受腫瘤壞死因子（TNF）、核因子受體活化因子配體（RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）等調控[43]。外泌體可通過蛋白或miRNA 調控骨髓微環(huán)境，抑制破骨細胞活性。前列腺癌細胞外泌體通過下調破骨細胞內miR-214 和阻斷NF-κB 信號傳導，抑制破骨細胞分化[44]。前列腺癌細胞外泌體可降低DC-STAMP、TRAP、組織蛋白酶K 和MMP-9 等破骨細胞標志物的表達，抑制破骨細胞的增殖和分化，從而調控骨形成[45]。脂肪間充質干細胞外泌體不僅降低RANKL 的mRNA和蛋白水平，而且降低RANKL/OPG 比例，從而抑制RANKL 介導的破骨細胞分化[46]。雌激素缺乏骨質疏松模型小鼠注射內皮細胞來源的外泌體后，破骨細胞活性降低，有效抑制骨質疏松的發(fā)展[47]。此外，破骨細胞源性外泌體可作為破骨細胞與成骨細胞間的媒介，調控成骨細胞的活性和骨生成功能。成熟破骨細胞外泌體可抑制成骨細胞內Wnt/β-catenin 信號傳導通路，并誘導成骨細胞凋亡，促進骨質疏松的發(fā)展[48]。破骨細胞外泌體富含miRNA，通過miRNA 抑制成骨細胞活性。破骨細胞外泌體通過ephrinA2 和EphA2 之間的相互作用特異性識別成骨細胞，并將miR-214 轉移至成骨細胞內，最終導致成骨細胞功能障礙[49]。另一項實驗證實，破骨細胞源性外泌體miR-214-3p 可靶向成骨細胞，在體外抑制成骨細胞活性和體內抑制骨的形成，但體內注射antagomir-214-3p 則可有效增強骨形成[50]。因此，外泌體中miR-214 或miR-214-3p 不僅可作為骨量減少的生物標志物，而且可以作為促進骨再生的治療靶點。此外，有研究顯示RANKL 可誘導破骨細胞源性外泌體內miR-23a-5p 表達，而 miR-23a-5p 可抑制Runx2 表達，促進YAP1 介導的MT1DP，從而抑制成骨細胞分化[51]?？傊?，外泌體可調控破骨細胞活性，介導骨再生的發(fā)展。而破骨細胞外泌體在成骨細胞功能和骨再生的調控中也發(fā)揮作用，而且其中某些特定的miRNA 可作為骨量減少等疾病的診斷標志物和治療靶點。

2.4 外泌體與間充質干細胞 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）廣泛存在于各種組織器官內，是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞。MSCs 具有促進組織損傷修復和免疫調節(jié)等能力，但其機制有待明確[52]。MSCs 移植后存活的數量有限，難以通過新分化的細胞替代受損細胞達到修復組織損傷的作用，而其旁分泌作用才可能是主要機制[53]。研究證實，MSCs 分泌的外泌體具有促進皮膚愈合[54]、修復腎損傷[55]和缺血性心肌損傷[56]等作用。將MSCs 外泌體注射到股骨骨折的CD9-/-小鼠體內，可加速小鼠骨折愈合[57]。人誘導的多能干細胞的MSCs 外泌體可有效促進卵巢切除大鼠極限顱骨缺損的骨再生和血管生成，此作用隨外泌體濃度的增加而增強[35]。此外，MSCs 可向成骨、成軟骨等方向分化，在軟骨、骨再生和修復中具有重要作用[58]。一些特定組織或細胞來源的外泌體可促進MSCs 的成骨分化，提示其在骨再生中的潛能。人脂肪干細胞外泌體可誘導人MSCs 的成骨分化、增殖和遷移，與PLGA/pDA 支架復合后可促進新骨形成，修復小鼠骨缺損[59]。樹突細胞外泌體可促進人MSCs 向成骨細胞分化，并提高MSCs 內ALP 和RUNX2 表達，這可能是其促成骨分化的潛在機制[60]。此外，另有研究發(fā)現MSCs 在成骨分化的不同階段，其外泌體miRNA的表達譜隨之改變。利用微陣列分析未分化和已成骨分化的脂肪干細胞外泌體中的miRNA 表達譜，發(fā)現有 201 種 miRNA 表達上調，33 種 miRNA 表達下調，而差異表達的miRNA 可調控成骨分化。因此，通過改變外泌體miRNA 的表達可促進脂肪干細胞的成骨分化[61]。研究證實，MSCs 攝取脂肪來源干細胞外泌體后，細胞內miR-223 表達降低，從而促進MSCs 成骨分化[62]。綜上表明，MSCs 外泌體在骨形成中起重要作用，可通過調控MSCs 的成骨分化促進骨再生，為骨再生的治療提供新思路。

3 外泌體治療優(yōu)勢與局限性

與細胞治療相比，外泌體作為新的治療策略具有多種優(yōu)勢。外泌體可避免因細胞移植而引起的腫瘤、移植物抗宿主病和栓子形成等并發(fā)癥的發(fā)生，安全性更高[63]。與細胞療法不同，外泌體沒有異倍體風險，大大降低在同種異體給藥后出現免疫排斥的可能性[64]。而與生物納米材料相比，外泌體具有較高的生物相容性、更低的細胞毒性。此外，外泌體因優(yōu)選的腫瘤歸巢性、可調節(jié)的靶向效率以及穿過細胞膜或血腦屏障等能力，成為遞送藥物和基因的理想載體[65]。目前已有研究將阿霉素、miR-143 包裹在外泌體內，用于骨肉瘤治療[66-67]。

然而，外泌體在骨再生的臨床應用還存在諸多限制和挑戰(zhàn)。首先，如何大量高效地從各種體液或細胞培養(yǎng)液中分離提純外泌體以及運輸儲存是一大難題。目前外泌體提取方法主要是超速離心、免疫吸附、沉淀、微流體分離[68]。體外分離產量低，且易受到蛋白或其他胞外囊泡的污染，而儲存溫度、儲存液pH 和凍融循環(huán)也可影響外泌體活性和靶細胞對其的攝取量[69]。其次，提高外泌體到達靶細胞的準確性也是臨床應用面臨的問題。大多數研究表明，外泌體在全身給藥后難以達到預期的治療效果[70]。因此，避免外泌體被巨噬細胞吞噬，并能在體內長時間循環(huán)，從而可以到達靶細胞，也是外泌體臨床應用的基礎。最后，保證外泌體的安全性是臨床應用的前提。有研究表明，外泌體可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，促進腫瘤的生長[71]。因此，限制外泌體潛在的促腫瘤作用是必須解決的問題。

4 小 結

本文闡述了外泌體的形成、分泌及攝取的相關機制，以及外泌體作為細胞間中通訊的重要介質參與骨再生中多種細胞間的信號傳導及骨再生過程。但外泌體介導骨再生的分子機制十分復雜，同時外泌體的臨床應用還存在一系列需要克服的難題。目前外泌體的研究處于初級階段，隨著研究的不斷深入，外泌體必有望成為骨再生領域具有良好前景的治療策略。