陳曉雪 馬秀梅 賈宇臣

腦卒中是威脅人類生命健康的主要疾病之一，在我國是成人致殘率及致死率的首位病因，其中缺血性腦卒中占比約85%，具有發(fā)生率高、致死率高及致殘率高的特點[1]。急性缺血性腦卒中治療的一個主要目標是恢復腦血流，但由于溶栓時間窗狹窄，能進行溶栓治療的患者比例很小，即使進行有效溶栓后，患者仍要面臨一個威脅——缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, I/R損傷)[2]。盡管進行再灌注后會不可避免再次致使神經(jīng)元損傷，但目前組織纖溶酶原激活劑治療仍是治療缺血性腦卒中最有效的策略[3]。近年來，有多種干預方式試圖降低這種因再灌注給缺血腦組織帶來的二次傷害，但臨床上反饋的結果不甚理想，所以積極地探索一種能有效防治腦I/R 損傷的方法至關重要。自噬已被證實參與了腦I/R 損傷，并且在近年來被看作可能是腦I/R 損傷的一個新的治療靶點。

一、腦I/R 損傷中的細胞損傷機制

在大腦發(fā)生血供障礙時，缺血區(qū)域的神經(jīng)細胞會面臨自由基堆積、興奮性氨基酸毒性及DNA損傷等危害，最終導致不可逆的死亡，這種因為生存環(huán)境“脅迫”發(fā)生的快速死亡被稱為壞死，并伴隨著炎性細胞因子的大量釋放[4]。但實際上在腦缺血發(fā)生時，導致細胞死亡的方式并非只有這一種，還包括凋亡及自噬等至少3種行為參與了細胞死亡過程。細胞凋亡是一種由基因嚴格調(diào)控的程序化細胞死亡行為，在再灌注損傷過程中因活性氧生成而被激活，不伴有炎性細胞因子的釋放。凋亡的發(fā)生可分為兩種途徑，一種是死亡受體介導外源性途徑激活細胞內(nèi)凋亡酶caspase，另一種是線粒體介導的內(nèi)源性途徑，因缺氧、輻射或毒素激活破壞了線粒體膜的完整性，從而激活凋亡相關蛋白Bcl-2家族[5]?？傊蛲鰩淼慕Y果也是導致細胞走向死亡，在腦缺血發(fā)生或是缺血再灌注后，抑制凋亡的發(fā)生總能挽救瀕死的神經(jīng)細胞，這一點隨著研究愈發(fā)明確。自噬是自噬體吞噬細胞質(zhì)內(nèi)變性的細胞器、蛋白質(zhì)并與溶酶體相融合，形成自噬溶酶體進而降解內(nèi)容物以實現(xiàn)再利用的過程，是非caspase介導的嚴格程序化的過程[6]。已有大量研究證明自噬在腦缺血再灌注損傷過程中至關重要，自噬的調(diào)節(jié)在再灌注階段對受損神經(jīng)細胞的轉歸起著舉足輕重的作用。在正常情況下，自噬能清除受損的細胞器和蛋白質(zhì)，從而維持細胞生存環(huán)境的穩(wěn)定，但值得研究的是，在應激反應下自噬與凋亡和壞死導致的結果不同，應激狀態(tài)下自噬被激活后在不同的研究中可能產(chǎn)生完全不同的結果，也許通過激活/抑制自噬又能成為細胞的保護機制。

二、自噬的概述

1.自噬的過程：哺乳動物細胞自噬有3種途徑：微自噬、伴侶介導的自噬和宏觀自噬，宏觀自噬是最常見和最活躍的自噬形式。自噬是高度保守嚴格程序化的過程，大致包括自噬體起始、延伸、成熟和與溶酶體融合這幾個過程。在自噬激活后，首先誘導形成一個雙層膜隔離室結構，這一起始過程需要兩大分子復合物參與，一個是Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復合物(PI3K-Ⅲ)，PI3K-Ⅲ/Vps 34的激活以及Vps 34活性的產(chǎn)物磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)對自噬的起始階段十分重要[6]。另一個大分子復合物是ULK復合物，由自噬相關基因13(autophagy-related gene 13, Atg13)、Atg101、FIP200和ULK1或其同系物ULK2組成，Atg13結合ULK1/ULK2，并介導它們與FIP200的結合，激活ULK，促進ULK對FIP200的磷酸化來啟動自噬體的形成[7]。形成自噬體前的雙層膜結構需要通過延伸來包裹所需降解的胞內(nèi)大分子結構，這一過程可能需要借助其他細胞器的膜。自噬相關基因Atg家族可能在此過程發(fā)揮了作用，除此之外還需要其他兩種泛素樣反應的參與。成熟的自噬體沿著微管雙向運動，在一些蛋白的驅(qū)動下，自噬體膜與溶酶體膜相互融合形成自噬溶酶體，其所攜帶的底物在溶酶體酸性環(huán)境和各種水解酶的作用下被降解，在此過程中底物被降解為氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)被再次利用[8]。

2.自噬常用檢測蛋白——LC3、p62與Beclin-1：LC3即微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)是Atg8的哺乳動物同源蛋白，是唯一與自噬體特異相關且不與其他囊泡結構相關的已知蛋白。它最初以pro-LC3的形式被合成，先通過蛋白水解去除C-末端轉化為LC3Ⅰ，接著與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)結合轉化為LC3Ⅱ。LC3Ⅰ定位于胞質(zhì)，LC3Ⅱ定位于自噬體的膜內(nèi)及膜外，最終在與溶酶體相融合最終在溶酶體內(nèi)被降解[9]。因此LC3Ⅱ的表達量代表著自噬體的數(shù)量水平。

p62又稱SQSTM，是典型的自噬受體，是一種多功能蛋白，位于胞質(zhì)參與多種信號轉導途徑。p62有形成聚集體的能力，其包括多個結構域調(diào)節(jié)不同的信號通路。p62能通過LC3相互作用區(qū)(LC3 interacting region, LIR)將泛素化的蛋白傳遞給LC3接著定位于自噬體上，作為自噬的底物被溶酶體降解[10]。因而p62蛋白表達水平與自噬的水平呈負相關。

Beclin-1是Atg6的哺乳動物同源蛋白，對自噬體的形成和成熟起著重要的作用，它調(diào)節(jié)PI3K-Ⅲ的催化單元Vps 34的激酶活性生成PI3P，通過PI3P的生成，Beclin-1-Vps34復合物可以招募參與自噬體形成的重要自噬蛋白并為其提供一個平臺，PI3K-Ⅲ/vps 34及其含有Beclin-1的復合物是自噬早期吞噬泡形成所必需的[11]。因此Beclin-1的表達量與自噬水平呈正相關。

LC3Ⅱ存在于自噬體膜，在自噬體與溶酶體結合后會被降解，因此LC3Ⅱ的表達水平僅代表了自噬體通量，因溶酶體功能障礙或其他原因所致的自噬過程不完整時，LC3Ⅱ的表達量并不能代表真實的自噬水平。p62擁有多個結構域調(diào)節(jié)不同的信號通路，包括參與血管生成和早期心血管發(fā)育或細胞極性等，而且p62的水平也并不總是與自噬呈反比，在長期饑餓狀態(tài)下甚至能誘導提高自噬的水平[12]。Beclin-1是一種平臺蛋白，它能與幾種不同的蛋白相互作用形成不同的蛋白質(zhì)復合物，除了與PI3K-Ⅲ和其他蛋白質(zhì)作用外還能與抗凋亡的Bcl-2家族成員結合，在細胞凋亡方面也起著重要的作用[13]。綜上所述，這3種蛋白雖然都與自噬水平關系密切，但單一蛋白水平的變化并不能完全代表真實完整的自噬水平，因此在觀察自噬水平時，最好選用多個蛋白對比觀察分析。

三、自噬參與腦I/R損傷的可能分子機制

1.PI3K-Akt-mTOR通路：PI3K、Akt和mTOR通路在神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷中起著重要作用。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第3位羥基磷酸化的磷酯酰肌醇激酶, 可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。PI3K-Ⅰ激活可抑制細胞自噬, PI3K-Ⅱ被認為與自噬關系不大，PI3K-Ⅲ的激活可促進細胞自噬[14]。PI3K被激活后能激活磷酸肌醇依賴酶PDK1和PDK2，從而導致Akt磷酸化[10,15]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR) 是一種進化上較為保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)控轉錄、細胞骨架和細胞代謝，mTOR信號依賴于雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin complex1,mTORC1)和mTORC2，mTORC2對自噬調(diào)節(jié)的貢獻微乎其微，mTORC1被認為是哺乳動物細胞中主要的自噬抑制因子[6]。Akt是mTORC1的一個強刺激因子，可通過結合和干擾多種蛋白來激活mTORC1，mTORC1磷酸化抑制了Atg13從而抑制自噬。ULK1和ULK2是Atg1的兩個哺乳動物同源蛋白，F(xiàn)IP200是一種ULK結合蛋白，F(xiàn)IP200和Atg13對于ULK1的穩(wěn)定和激活至關重要，mTOR通過磷酸化Atg13和ULK來抑制ULK-Atg13-FIP200復合物的形成，從而防止哺乳動物細胞自噬[10]。雷帕霉素是mTOR的一種抑制劑，可以阻止這一過程來促進自噬，在饑餓、缺乏養(yǎng)分或mTOR被抑制時，Atg13和ULK1/2被去磷酸化從而激活ULK1/2，使FIP200磷酸化并與Atg1結合激活Atg1參與誘導自噬體的形成[16]。

2.AMPK-mTOR通路：腺苷-磷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]是真核細胞中最重要的分子能量傳感器之一，其活性能夠控制多種代謝過程，將細胞代謝與能量供應聯(lián)系起來。每個AMPK復合體都由一個α亞基、β亞基和γ亞基構成。其中γ亞基作為一種傳感器，使AMPK能夠感知一磷酸腺苷(adenosine-monophosphate，AMP)、二磷酸腺苷(adenosine-diphosphate, ADP)、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate, ATP)的水平變化，以及能在AMP/ATP和ADP/ATP的比值變化時作出反應[17]。在面對腦I/R損傷導致的能量脅迫時，AMPK直接激活代謝酶，調(diào)節(jié)不同的能量消耗和能量產(chǎn)生途徑以維持足夠的能量平衡，如抑制消耗ATP的代謝過程(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的生物合成)，激活合成ATP的分解過程(例如葡萄糖的攝取和代謝)[18]。AMPK的激活正向調(diào)節(jié)自噬活性，抑制mTORC1的活性是AMPK促進自噬的主要機制之一，另外一個機制是AMPK對ULK 1復合物的活性起著與mTORC1相反的作用，從而對自噬體形成的第一步就進行了積極的調(diào)控。此外，AMPK對自噬的調(diào)節(jié)還可以通過磷酸化不同的Ⅲ類PI3K復合物的不同亞基來實現(xiàn)的(例如vps34)，AMPK活化既能增強親自噬的vps34復合物活性，又能抑制其他與自噬無關的Ⅲ類PI3K復合物的形成[19]。

3.p38 MAPK通路：p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶家族成員，參與多種細胞活動，包括細胞增殖、分化、自噬和凋亡等。MAPK家族包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶1-3(c-Jun N-terminal kinase, JNK1-3)、p38(α、β、γ和δ)和ERK 5家族，這些通路在腦缺血后均能被激活，尤其是p38和JNK在炎性介導的缺血損傷中起著重要作用[20]。p38α MAPK通路對自噬的調(diào)控在緩解炎癥信號中起著直接作用。He等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖(lipopolysacchride, LPS)刺激小膠質(zhì)細胞后，p38α MAPK能直接磷酸化自噬起始復合物中的ULK1，通過抑制ULK1的活性，破壞了自噬起始復合物中的ATG1相互作用，從而降低了自噬的通量和水平，這表明激活p38α MAPK能抑制自噬水平。此外，其團隊還發(fā)現(xiàn)p38α MAPK通路的激活是原代小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生白介素-1β(IL-1β)的必要條件，在沒有任何明顯的炎癥刺激的情況下僅抑制ULK1就足以促進炎性反應。但在另外幾項研究中，p38 MAPK對自噬的調(diào)節(jié)卻是反方向的，Xue等[22]研究發(fā)現(xiàn)，抑制JNK/p38級聯(lián)通路的激活能負調(diào)控OGD處理的PC12細胞的自噬水平，從而抑制細胞凋亡水平。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，抑制p38 MAPK通路可減輕缺血發(fā)作后的線粒體有絲分裂，減少線粒體自噬以維持線粒體的含量?？v使p38 MAPK在腦I/R損傷中的對自噬的調(diào)控不十分清晰，但以上研究結果也能提示p38 MAPK通路在缺血損傷中具有潛在的神經(jīng)保護作用。

四、自噬與腦缺血再灌注損傷的關系

腦I/R損傷是一個復雜的多環(huán)節(jié)的過程，越來越多的證據(jù)表明，自噬可能在神經(jīng)元的存活和死亡中起到關鍵作用。抑制自噬被認為可以減輕腦I/R損傷，似乎抑制自噬是預防腦I/R損傷的一種新策略，確實很多研究表明自噬可能是神經(jīng)保護性的，但也另有一些研究得出了相反的結論。

1.自噬減輕腦缺血再灌注損傷：近年來多篇研究提示，無論在體內(nèi)模型還是體外模型中，再灌注期間抑制自噬均不利于神經(jīng)細胞的存活。研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷Ⅳ在體內(nèi)能通過促進自噬減少大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠的腦梗死體積，減輕腦缺血再灌注損傷，在體外能提高HT22細胞的活力，降低凋亡率，同時降低p62的表達，增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達[24]。研究還發(fā)現(xiàn)很多藥物或者處理措施也是通過激活自噬來發(fā)揮的保護作用，如Sun等[25]研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注階段，缺血后處理(ischemic post-conditioning, IpostC)減少了線粒體細胞色素C的釋放，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)在抑制自噬時也抑制了IpostC的這種保護作用，這表明IpostC通過激活自噬加速清除了受損的線粒體，而這有利于神經(jīng)元的存活。He等[26]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在大鼠腦I/R階段增強了自噬，并通過增強自噬活性來抑制炎性小體NLRP3的激活，以減輕腦I/R所致的炎癥損傷，表現(xiàn)為LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的增加和p62表達的降低，并且3-MA預處理時增強了NLRP3的表達。這些數(shù)據(jù)表明激活自噬在缺血再灌注中的具有保護作用。

2.自噬加重腦缺血再灌注損傷：腦缺血再灌注過程中自噬激活有助于清除受損的細胞器，促進能量和物質(zhì)的循環(huán)，常被認為是一種保護機制，但也有報道稱過度的自噬形成可加重神經(jīng)元的凋亡、壞死。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19通過激活自噬而導致氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation-reperfusion，OGD/R)造成的SH-SY5Y 細胞活力損傷加重。Jiang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，外源性硫化氫鈉可減輕MCAO誘導的大鼠腦I/R損傷以及OGD/R誘導的PC12細胞損傷。透射電鏡顯示硫化氫鈉減少了MCAO處理后的大鼠腦內(nèi)發(fā)生自噬的細胞數(shù)目。硫化氫鈉對OGD/R誘導的PC12細胞caspase-3和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性有抑制作用，而雷帕霉素作用后削弱了這種抑制作用，相反，應用3-MA處理時這種保護作用被增強，這說明過度激活的自噬加重了OGD/R所致的細胞損傷，抑制過度激活的自噬可以保護受損的神經(jīng)細胞。Luo等[29]研究發(fā)現(xiàn)，右旋美托咪啶(DEX)通過抑制缺血腦組織神經(jīng)元的自噬，與DEX+雷帕霉素比較，單獨DEX處理和DEX+3-MA處理在再灌注24h后，腦梗死范圍縮小，神經(jīng)功能障礙改善，DEX降低了原代神經(jīng)細胞LC3和Beclin-1的表達，抑制凋亡和自噬水平。這些數(shù)據(jù)表明自噬的激活在缺血再灌注階段是有害的。

五、展 望

目前對自噬在腦I/R損傷中的具體作用的爭議可能與自噬復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡、體外細胞造模方式不同、體內(nèi)造模缺血時間不等、再灌注時間的差異以及治療干預方式的不同有關。因此，通過抑制/增強自噬來保護缺血組織的想法可能需要綜合考慮多種因素的影響來進行研究。缺血性腦卒中的發(fā)生率逐年增高，高致殘率使患者的生活質(zhì)量嚴重下降，自噬也許給腦卒中治療帶來了新的思路。自噬通過多種信號途徑參與了腦缺血再灌注階段的病理轉歸，主要包括PI3K-Akt-mTOR通路、AMPK-mTOR通路和p38 MAPK通路等，又通過這些通路調(diào)控線粒體應激、炎性細胞因子及凋亡等機制來影響腦I/R損傷的最終結果。今后還需要開展深入的研究闡述自噬在腦I/R損傷中的作用通路及其對神經(jīng)元最終命運的影響，為自噬成為臨床上治療腦缺血再灌注損傷的新靶點提供依據(jù)。