覃文聘 閆艦飛 焦 凱

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是人類最常見的關節(jié)退行性疾病，最新的全球疾病負擔研究的數(shù)據(jù)顯示全世界大約有2.42億人罹患骨關節(jié)炎[1]。隨著社會人口老齡化，這個數(shù)字還在快速上升，由OA疾病引起的經(jīng)濟投入占到發(fā)達國家GDP總量的1.0%～2.5%[2, 3]。OA較高的發(fā)生率及其所帶來的危害使其成為致殘的重要原因[4]。隨著疾病的發(fā)展，OA進展到晚期往往需要關節(jié)置換，給患者帶來極大的痛苦以及沉重的經(jīng)濟負擔[5]。目前認為OA發(fā)病為多因素共同作用的結(jié)果，其致病因素包括異常生物力、遺傳因素、細胞老化與凋亡、局部炎性因子、自由基及蛋白酶等。關節(jié)軟骨退變被認為是OA典型的病理特征，由于軟骨組織中沒有血管和淋巴管，因而軟骨細胞被認為生活在缺氧的環(huán)境中。線粒體，一個在有氧的條件下進行氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)反應，再經(jīng)過三羧酸循環(huán)、電子傳遞，最終產(chǎn)生ATP，為細胞的生命活動提供能量的細胞器，在軟骨細胞代謝活動中的作用研究就相對較少，但新近研究顯示線粒體結(jié)構(gòu)以及功能異常與OA軟骨退變的發(fā)生、發(fā)展關系密切，本文就該領域的最新研究做一綜述。

一、OA中線粒體的改變

1.線粒體呼吸鏈(mitochondrial respiratory chain, MRC)損傷：線粒體呼吸鏈是位于線粒體內(nèi)膜上的一系列電子和質(zhì)子傳遞體系，包括復合體Ⅰ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)-CoQ氧化還原酶，復合體Ⅱ琥珀酸-CoQ氧化還原酶，復合體ⅢCoQH2-細胞色素c氧化還原酶，復合體Ⅳ細胞色素c氧化酶。線粒體膜電位(Δψm)是質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運時形成的跨線粒體內(nèi)膜的電位，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP等生理過程的重要前提。Maneiro等[6]通過分析呼吸鏈酶復合物和檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)活性以及線粒體膜電位的變化來評價OA軟骨細胞與正常軟骨細胞線粒體的功能差異，實驗中對照組軟骨來自無關節(jié)病史而且大體正常的人膝關節(jié)軟骨，OA組軟骨來自準備進行關節(jié)置換的股骨頭OA軟骨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組關節(jié)軟骨細胞比較，OA軟骨細胞CS活性顯著升高，復合體Ⅱ和Ⅲ活性顯著降低，復合體Ⅰ及Ⅳ活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。隨后，他們通過熒光探針四乙基苯并咪唑碘化物JC-1測定線粒體Δψm的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA軟骨細胞具有比對照軟骨細胞更低的紅綠熒光比率，即OA軟骨細胞線粒體去極化更為明顯，且Δψm顯著降低。上述結(jié)果表明OA軟骨細胞存在MRC功能障礙，造成電子傳遞效率下降進而導致ATP合成量下降及Δψm的降低。

研究表明MRC功能障礙可產(chǎn)生更多的漏電子, 使得氧自由基增加，高水平的氧自由基可通過脂質(zhì)氧化作用破壞細胞膜，使細胞發(fā)生自溶；其次，氧自由基可以使DNA鏈發(fā)生斷裂，造成DNA堿基的損傷；同時，氧自由基還可阻止透明質(zhì)酸酶的合成并使其降解，導致關節(jié)滑液黏度降低，關節(jié)的潤滑機制遭到破壞；氧自由基還會影響花生四烯酸的代謝，促進其酶促反應的發(fā)生，產(chǎn)生炎性反應。有研究已經(jīng)證實MRC功能障礙會導致軟骨細胞發(fā)生炎性反應，并上調(diào)其COX-2和PGE2的表達[7]。Reed等[8]通過分離培養(yǎng)新生鼠肋軟骨細胞，并用不同濃度的氧化應激誘導劑甲萘醌處理細胞1h后,分別即刻收集細胞或培養(yǎng)1或24h后收集細胞，用線粒體超氧化物指示劑MitoSOX重懸細胞，通過流式細胞儀分析樣品中線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，通過Southern法分析mtDNA的損傷，通過Western blot法分析金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的生成，結(jié)果顯示，與對照組比較，甲萘醌可顯著促進軟骨細胞線粒體ROS的產(chǎn)生，這種顯著的差異甚至在甲萘醌處理后24h仍持續(xù)存在；mtDNA的損傷和MMPs的產(chǎn)生均隨甲萘醌濃度升高而加重。上述結(jié)果表明氧化應激的線粒體會生成更多的ROS，并對mtDNA造成損傷且促進MMPs表達。

此外，Cillero-Pastor等[9]證明了MRC功能障礙會造成軟骨細胞中MMPs的過度表達，進而導致軟骨的降解破壞。MMPs能夠降解細胞外基質(zhì)，其中膠原酶MMP-1，MMP-8，MMP-13分別主要以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原為水解底物，間質(zhì)溶解素MMP-3可以降解蛋白聚糖等，因此MMPs可以對關節(jié)軟骨的纖維軟骨結(jié)構(gòu)造成破壞，使軟骨基質(zhì)降解，在OA的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要的角色。Cillero-Pastor等[9]以正常人膝關節(jié)軟骨細胞為研究對象，使用MRC復合物Ⅴ抑制劑寡霉素處理細胞后，分別使用實時定量PCR技術(shù)、Western blot法及ELISA等方法研究了MMPs的mRNA和蛋白質(zhì)的表達及組織中蛋白多糖的含量變化，結(jié)果顯示，經(jīng)處理的軟骨細胞MMP-1和MMP-3 mRNA及蛋白表達水平較溶劑對照組顯著上調(diào)。他們用同樣的方法刺激體外培養(yǎng)的軟骨組織塊，所獲得的結(jié)果與細胞水平的結(jié)果一致，表明當軟骨細胞存在MRC功能障礙時，其可通過調(diào)節(jié)軟骨細胞中MMPs的表達來促進OA軟骨退變的進展。

另外，有使用關節(jié)軟骨的體外研究表明，使用特定的MRC抑制劑可抑制蛋白多糖和膠原的合成，如在體外使用魚藤酮抑制復合物Ⅰ降低了表面和中間軟骨的蛋白多糖含量[10，11]。

2.線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的改變：mtDNA編碼細胞色素c氧化酶復合體(復合體Ⅳ)催化活性中心的亞單位(COXⅠ、COXⅡ、COX Ⅲ)及ATP酶亞單位等蛋白質(zhì)、多肽和RNA，控制著線粒體氧化磷酸化和ATP的合成等過程。線粒體呼吸鏈是產(chǎn)生內(nèi)源性氧自由基的主要場所之一，mtDNA由于結(jié)構(gòu)和位置的特殊性，使其更容易被氧自由基攻擊。氧自由基可以使DNA鏈發(fā)生斷裂并阻斷DNA分子的修復以及合成，從而造成DNA堿基的損傷。已有研究證實OA患者中mtDNA損傷要高于正常人而其修復能力則低于正常人[12]。

流行病學研究也發(fā)現(xiàn)mtDNA單倍群類型與OA患病風險存在一定的相關性。mtDNA單倍型群,定義為以mtDNA序列中存在一組特定的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)為特征的個體群，是人類mtDNA中最常見的遺傳突變的結(jié)果，并且當人類遷徙到較冷的氣候時，它們會受到氣候選擇的影響[13]。有研究表明mtDNA單倍群G的人群發(fā)生膝關節(jié)OA的風險會顯著增加，而單倍群B4的人群發(fā)生膝關節(jié)OA的風險則相對較低[14]。王宇等[15]通過對187 例膝關節(jié)OA 患者的研究同樣發(fā)現(xiàn)，mtDNA單倍群G在OA患者中出現(xiàn)的頻率明顯高于對照組，而且病情更為嚴重，而mtDNA單倍群B和B4在OA患者中出現(xiàn)頻率則明顯較低。 Soto-Hermida等[16]通過對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者4年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，在常見的歐洲mtDNA單倍群中，mtDNA單倍群T的膝關節(jié)軟骨厚度和體積與其他mtDNA單倍群的變化比較顯著減慢，而且變化幅度顯著降低，表明mtDNA單倍群T對OA的發(fā)生同樣具有保護作用。Fernández-Moreno等[17]利用具有相同核背景的骨肉瘤細胞系，通過融合來自攜帶單倍群J或H的健康供體的血小板來培養(yǎng)線粒體細胞系，其中一個具有單倍群J(與OA低風險相關)，另一個具有單倍群H(與OA的高風險相關)，在用過氧化氫處理后發(fā)現(xiàn)，在OA中的軟骨細胞存活率單倍群H只有單倍群J的一半。

對于mtDNA單倍型群對OA的作用機制仍有待于探究，目前發(fā)現(xiàn)mtDNA單倍型群對能量產(chǎn)生、NO的形成有重要影響[13]。一方面，不同的單倍型群的氧化磷酸化系統(tǒng)(oxidative phosphorylation system, OXPHOS)耦合效率存在差異，緊密耦合的OXPHOS會產(chǎn)生大量的ATP和少量的熱量，而部分不耦合的OXPHOS則產(chǎn)生少量的ATP和大量的熱量。單倍型J和單倍型T，兩種被證明對OA的發(fā)生有保護作用的mtDNA單倍型群，被描述為姐妹單倍型群，兩者均有部分非耦聯(lián)OXPHOS的特征，并產(chǎn)生較低的ATP和ROS；而單倍型H則有較強的OXPHOS耦聯(lián)效率和較高的ATP產(chǎn)生量[18]。另一方面，mtDNA單倍型群會影響細胞內(nèi)NO的產(chǎn)生。關節(jié)軟骨內(nèi)NO能與超氧陰離子結(jié)合生成過氧亞硝酸鹽，通過酪蛋白激酶2(casein kinase 2, CK2)信號激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)，導致軟骨細胞血紅蛋白加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)上調(diào)，從而損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂類以及染色體端粒，進一步導致細胞質(zhì)丟失和細胞死亡[19]。最近研究表明，單倍型J攜帶者的軟骨細胞中NO的產(chǎn)生和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)mRNA合成降低[20]。這些研究說明mtDNA單倍群的類型與膝骨關節(jié)炎的發(fā)生有一定相關性，對mtDNA單倍群的分組可對OA治療相關的臨床試驗有所幫助[21]。

3.線粒體自噬的異常：自噬是細胞移除自身內(nèi)部受損的大分子和細胞器、維持其穩(wěn)態(tài)的重要途徑，其中線粒體自噬是一種選擇性清除受損線粒體的特異性自噬類型[22]。在應激狀態(tài)下，當線粒體的融合與分裂已無法降低應激效應時，分裂時產(chǎn)生的膜電位較低的線粒體則會發(fā)生線粒體自噬，從而幫助細胞自身去除受損的線粒體。該過程由兩種不同的分子途徑介導：PTEN誘導激酶1(PTEN induced putative kinase1, Pink1)/Parkin途徑以及維BH3結(jié)構(gòu)域蛋白2家族成員(BH3-only member of the Bcl-2 family, Nix)/Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣蛋白(adenovirus E1B19kDa interacting protein 3-like, BNIP3L)途徑。當線粒體自噬過程出現(xiàn)異常時，就會導致受損線粒體的更新發(fā)生障礙以及ROS的過量累積，從而造成細胞的氧化應激損傷。Lopez等[22]以永生化的人軟骨細胞TC28a2系細胞作為研究對象，使用線粒體呼吸鏈復合物Ⅴ抑制劑寡霉素處理細胞，結(jié)果顯示寡霉素處理組軟骨細胞表達自噬體標志物輕鏈3膜結(jié)合形式Ⅱ(LC3)斑點較溶劑對照組顯著減少，進一步蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，細胞LC3-Ⅱ的表達在寡霉素處理后24h增加，至48h開始減少。他們認為LC3-Ⅱ表達的增加可能是早期的應激反應，最終LC3-Ⅱ表達減少表明在線粒體功能障礙時，自噬激活減少。他們進一步通過構(gòu)建自噬相關基因Atg5 siRNA的載體進入正常人軟骨細胞來抑制線粒體的自噬活動，發(fā)現(xiàn)線粒體Δψm降低和ROS產(chǎn)生增加，表明OA軟骨細胞存在線粒體自噬缺陷，從而導致功能障礙的線粒體在細胞內(nèi)異常積累，進而引起軟骨細胞代謝功能的紊亂。研究表明，軟骨的病理性礦化是OA 軟骨退變的典型特征，Pei等[23]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨病理性礦化可能與線粒體自噬活動密切相關，礦化前體非晶態(tài)磷酸鈣在線粒體中富集后通過囊泡轉(zhuǎn)運至細胞外的過程中存在線粒體的自噬現(xiàn)象。在線粒體中，鈣和磷聚集成非晶態(tài)磷酸鈣，其過度積累會導致Pink1在線粒體膜上的積累，進一步會誘導Parkin從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到功能失調(diào)的線粒體上，并以線粒體為靶點啟動線粒體自噬，自噬體攜帶非晶態(tài)磷酸鈣轉(zhuǎn)運到細胞外，從而啟動基質(zhì)的礦化。

4.線粒體鈣代謝的改變：線粒體不僅是細胞重要的能量代謝場所，同時是一個非常有效的維持細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的緩沖系統(tǒng)。研究顯示，線粒體功能和Ca2+動力學過程相互調(diào)節(jié)、密切交織[26]。線粒體跨膜電位是氧化磷酸化過程的基礎，同時也是Ca2+進入線粒體的驅(qū)動力；線粒體內(nèi)的Ca2+通過調(diào)節(jié)4種線粒體脫氫酶(丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、氧代戊二酸脫氫酶和甘油-3-磷酸脫氫酶)的活性，正向調(diào)控檸檬酸循環(huán)，從而促進線粒體膜電位的產(chǎn)生[24]。組織學上，細胞基質(zhì)內(nèi)Ca2+流入線粒體由線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白(mitochondrial calcium uniporter, MCU)控制；而流出則由線粒體Na+/Ca2+交換體控制。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 (mitochondrial permeability transition pore, mPTP )的瞬時開放也被認為是一種額外的Ca2+流出模式，與其他蛋白通道共同維持線粒體及細胞內(nèi)部鈣離子的穩(wěn)態(tài)。研究表明，骨關節(jié)炎軟骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)釋放的Ca2+和(或)由細胞外流入的Ca2+增加，會導致線粒體內(nèi)Ca2+濃度增加。增加的線粒體Ca2+通過刺激三羧酸循環(huán)的酶、氧化磷酸化來促進ATP合成，代謝率的增加會消耗更多的氧氣，導致細胞呼吸鏈電子泄漏和ROS水平增加，從而激發(fā)氧化應激損傷，進而促進軟骨退變的發(fā)生[25]。另一方面，由于線粒體Ca2+超載導致mPTP的開放，進一步造成Δψm突然下降和細胞色素c、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor, AIF)等促凋亡蛋白被釋放到細胞質(zhì)中，這一過程在細胞凋亡中起了關鍵作用。細胞凋亡可由兩種途徑造成：由位于細胞膜上的受體識別細胞外信號觸發(fā)的外在途徑和由DNA損傷或氧化應激等內(nèi)部事件觸發(fā)的內(nèi)在途徑，線粒體參與外在途徑的增強和內(nèi)在途徑的激活。

二、靶向調(diào)控線粒體功能阻斷骨關節(jié)炎進展

考慮到線粒體結(jié)構(gòu)以及功能異常與OA軟骨退變的發(fā)生、發(fā)展關系密切，靶向調(diào)節(jié)線粒體功能成為治療OA的新思路。Reed等假設軟骨基質(zhì)降解酶MMPs表達水平將隨著線粒體產(chǎn)生的ROS的減少而降低，因此抑制線粒體ROS的產(chǎn)生可起到阻斷OA軟骨退變的作用。他們采用線粒體靶向的抗氧化劑MitoTempo處理人骨關節(jié)炎軟骨細胞，該抗氧化劑具有超氧化物和烷基自由基清除性質(zhì)。OA軟骨細胞經(jīng)抗氧化劑處理后，其MMP3及MMP13的蛋白表達水平較溶劑對照組顯著降低，且該效應存在顯著的劑量及時間依賴效應，即在本研究條件下，抗氧化劑處理OA軟骨細胞時間越長，濃度越高，MMP3及MMP13的蛋白表達水平就越低，表明線粒體ROS的清除能顯著降低OA軟骨細胞分泌MMPs，從而發(fā)揮阻止OA軟骨退變進展的作用[8]。有研究者證實了具有抗氧化活性的脂聯(lián)素(adiponectin, APN)對H2O2誘導的細胞內(nèi)ROS可以清除活性，降低H2O2誘導的小鼠成肌細胞毒性，同時ANP可以恢復由H2O2抑制的成肌細胞的線粒體膜低電位，防止線粒體發(fā)生去極化。他們還發(fā)現(xiàn)APN可以抑制H2O2誘導的成肌細胞的線粒體自噬和細胞凋亡，但是關于其在軟骨細胞中是否可以發(fā)揮同樣的作用需要開展進一步研究。

自噬激活可以保護人軟骨細胞免受線粒體功能障礙所誘發(fā)的級聯(lián)病理反應。Lopez等[22]分別用雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC-1)靶向選擇性抑制劑雷帕霉素和mTORC-1和mTORC-2抑制劑Torin 1預處理TC28a2系軟骨細胞4h誘導自噬，隨后在指定的時間內(nèi)添加線粒體呼吸鏈復合物Ⅴ抑制劑寡霉素，通過測定自噬體形成標志物輕鏈3膜結(jié)合形式Ⅱ(LC3-Ⅱ)分析自噬激活。雷帕霉素處理組的Δψm增加，并且細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)，用Torin 1預處理也可以顯著增加Δψm(P<0.01)，而且伴隨著ROS產(chǎn)生和凋亡的顯著降低(P<0.05)，這一結(jié)果表明自噬激活對線粒體功能障礙具有保護作用。海藻糖作為一種新型自噬誘導物，Tang等[26]研究發(fā)現(xiàn)其在叔丁基氫過氧化物(tert-Butyl hydroperoxide, TBHP)處理的小鼠軟骨細胞和不穩(wěn)定的內(nèi)側(cè)半月板(destabilized medial meniscus, DMM)小鼠OA模型中均具有保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)海藻糖可以選擇性地恢復氧化應激誘導的自噬通量破壞和靶向自噬，改善氧化應激介導的線粒體膜電位變化，ATP水平降低，動態(tài)蛋白相關蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP-1)易位至線粒體，以及線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應激相關凋亡途徑中蛋白質(zhì)上調(diào)而具有抗凋亡的作用。

已知Pink1/Parkin通路是線粒體自噬的關鍵通路，當Pink1在外線粒體膜上聚集且穩(wěn)定化后將選擇性募集Parkin，在后者被募集到損傷的線粒體后，Parkin通過其E3泛素連接酶活性促進多種線粒體膜的降解。Ansari等[27]通過研究確定了Parkin在病理條件下清除損傷、功能失調(diào)的線粒體的功能。他們利用IL-1β刺激OA軟骨細胞未病變區(qū)域來模擬病理狀況，使用Amaxa系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Parkin突變體或野生型質(zhì)粒，通過測定Δψm、ROS水平和ATG5、Beclin1蛋白的自噬情況，最終證明在病理情況下，Parkin可以誘導自噬作用來消除軟骨細胞中去極化和損傷的線粒體，保證了線粒體的質(zhì)量。另外，caspase-9是線粒體凋亡途徑的關鍵組成部分，對caspase-9的抑制也是一種保持細胞活力的可能的方法[10]。在單側(cè)前交叉韌帶橫斷誘導犬OA時，用caspase-9抑制劑 Z-lehD-FmK體外培養(yǎng)的OA膝關節(jié)軟骨細胞凋亡程度明顯降低。

綜上所述，骨關節(jié)炎軟骨退變發(fā)生過程中存在線粒體功能的異常，主要包括線粒體呼吸鏈的破壞、線粒體DNA的受損、線粒體自噬活動以及鈣離子代謝的改變，從而導致軟骨細胞氧化應激損傷、基質(zhì)降解酶MMPs過量表達、軟骨基質(zhì)異常鈣化以及關節(jié)軟骨對各種刺激的耐受性顯著降低等病理改變，最終導致OA的發(fā)生和發(fā)展。在了解其發(fā)病機制的基礎上，研究者發(fā)現(xiàn)抑制線粒體呼吸鏈損傷及ROS產(chǎn)生、調(diào)控線粒體自噬功能能有效減緩OA軟骨退變的進程。但是目前的研究大都停留在理論研究，為了達到最終OA治療的目標，還需要深入的臨床前和臨床研究。