何薇，許艷華

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，昆明 650000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種多潛能干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、成核細(xì)胞和肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[1]。MSC可以從多種類型的間充質(zhì)組織中獲得，如骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、肺、肝和皮膚等[2]。與長骨相比，來源于頜骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有更強(qiáng)的成骨分化能力[3-4]。隨著對MSC生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等其他領(lǐng)域了解不斷加深，發(fā)現(xiàn)MSC為骨科、自身免疫和缺血性疾病提供了新的治療選擇[5]。人類基因組工程的完成，證實了93%的人類基因組能夠轉(zhuǎn)錄成RNA，但只有2%能夠被翻譯成蛋白質(zhì)，其余98%的RNA稱為非編碼RNA[6]。長度超過200個核苷酸的非編碼RNA被定義為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。盡管許多l(xiāng)ncRNA被認(rèn)為可能是轉(zhuǎn)錄噪聲或RNA加工時的副產(chǎn)物，但越來越多的證據(jù)表明它們中的很大一部分是功能性的，且參與調(diào)控各種類型細(xì)胞的生長和分化[7-9]。提高BMSCs成骨分化能力是抑制骨吸收、促進(jìn)骨改建的關(guān)鍵。已有研究證實，蛋白編碼基因和小的非編碼RNA參與了BMSCs向成骨細(xì)胞的分化[10]。雖然功能性lncRNA參與了BMSCs的成骨分化，但大多數(shù)lncRNA的功能尚不清楚。BMSCs的表達(dá)和分化是否依賴于LncRNA目前也不清楚?，F(xiàn)就lncRNA參與BMSCs成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及信號通路的研究進(jìn)展予以綜述。

1 lncRNA概述

近年來，在RNA測序技術(shù)的幫助下，已經(jīng)確定了數(shù)以千計的短鏈和長鏈非編碼RNA，揭示了大多數(shù)基因組實際上是轉(zhuǎn)錄的，但只有1%～2%的轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白質(zhì)[8]。而lncRNA與信使RNA類似，通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄并且被剪接和多腺苷酸化，但其沒有或只有很低編碼潛能。lncRNA主要表現(xiàn)為細(xì)胞類型和發(fā)育階段特異性表達(dá)模式，在調(diào)節(jié)多種多樣的細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要作用?；谂c附近蛋白質(zhì)編碼基因相關(guān)的基因組位置，可以將lncRNA分為有義、反義、內(nèi)含子、基因間和增強(qiáng)子lncRNA，同時lncRNA的功能也要復(fù)雜得多。lncRNA在不同的細(xì)胞類型中表現(xiàn)出特異性和多樣化的亞細(xì)胞定位，這取決于它們的分子功能。與微RNA(microRNA，miRNA)不同，lncRNA的功能并不局限于與其他RNA相互作用，lncRNA也可與蛋白質(zhì)和DNA相互作用，在不同的細(xì)胞間隔中表現(xiàn)出非常不同的分子功能[11]。首先，lncRNA通過與蛋白質(zhì)的相互作用，可以作為蛋白質(zhì)復(fù)合物的支架，指導(dǎo)靶向蛋白質(zhì)復(fù)合物(如染色質(zhì)修飾物)到特定的位點[12]，然后通過信號分子調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程，根據(jù)蛋白的亞細(xì)胞定位將蛋白從染色質(zhì)中隔離[13]。其次，核lncRNA也可直接或間接與基因組DNA相互作用，招募表觀遺傳修飾到一個特定的位點，而其他的lncRNA，如 XIST(long non-coding RNA X inactive specific transcript)和H19則結(jié)合鄰近的基因組位點，啟動基因組印跡[14]。最終，lncRNA通過控制細(xì)胞剪接、穩(wěn)定性和翻譯，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物直接與RNA相互作用而發(fā)揮功能[15]。

2 與lncRNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及信號通路

BMSCs向成骨細(xì)胞分化涉及復(fù)雜的信號通路，且多種細(xì)胞因子參與其中。通過基因芯片技術(shù)可以分析基因組的序列信息以及基因組之間的差異表達(dá)。Wang等[16]采用基因芯片技術(shù)首次揭示了lncRNA在人BMSCs成骨分化中的表達(dá)譜，在BMSCs成骨分化過程中共鑒定出1 206個與成骨表達(dá)差異的lncRNA。同時，有研究者使用微陣列的轉(zhuǎn)錄組譜分析BMSCs成骨分化過程中有差異表達(dá)的編碼和非編碼基因，并通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BMSCs成骨分化可能與多種信號通路相關(guān)，且lncRNA參與其中[17]。

2.1骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)與lncRNA BMSCs成骨分化受多種細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)控，BMP-2是眾所周知的BMSCs成骨分化的有效誘導(dǎo)因子[18-19]。而 HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是最早發(fā)現(xiàn)的反式作用lncRNA，在胃癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、急性白血病等多種腫瘤組織和細(xì)胞中均存在HOTAIR的異常表達(dá)[20]。Wei等[21]研究了HOTAIR在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中的成骨分化和增殖作用，提取股骨頭壞死患者的股骨BMSCs，分析HOTAIR在BMP-2誘導(dǎo)的成骨分化過程中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子BMP-2作用后，HOTAIR在BMSCs的表達(dá)顯著降低，提示HOTAIR可能是BMSCs分化過程中的重要因素；研究還顯示，HOTAIR下調(diào)導(dǎo)致BMP-2誘導(dǎo)的BMSCs中的 Ⅰ 型膠原α1鏈信使RNA表達(dá)增加，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性升高。這些數(shù)據(jù)證實HOTAIR是成骨分化的調(diào)節(jié)因子，也與股骨頭壞死疾病相關(guān)。Li等[22]也確定了一種lncRNA，即Bmncr，Bmncr在衰老過程中可以調(diào)節(jié)BMSCs的命運，Bmncr通過維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維調(diào)節(jié)素和激活BMP-2途徑來調(diào)節(jié)BMSCs的成骨，Bmncr通過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維調(diào)節(jié)素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附于骨表面，激活BMP-2通路，操縱BMSCs成骨穩(wěn)態(tài)環(huán)境，影響細(xì)胞成骨過程。

與其他BMPs不同，BMP-1不屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，BMP-1可以誘導(dǎo)骨和軟骨發(fā)育。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b-3p在骨質(zhì)疏松中高表達(dá)，通過熒光素酶活性可以測定BMP-1是miR-29b-3p的靶基因；進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear enriched transcript 1，NEAT1)對BMP-1具有正調(diào)節(jié)作用，同時lncRNA NEAT1對miR-29b-3p具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，NEAT1通過調(diào)節(jié)miR-29b-3p/BMP軸促進(jìn)BMSCs的成骨分化。這項研究確定了BMP-1和NEAT1在骨質(zhì)疏松癥中的潛在作用，有助于了解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，并找到治療骨質(zhì)疏松癥的新靶點。經(jīng)過進(jìn)一步的研究，利用生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn)，MSX1(muscle segment homeobox-1)、BMP-1和Smurf1這3個成骨基因周圍存在相關(guān)聯(lián)的lncRNA，其中2個lncRNA(AF289591和uc003xbe)與成骨基因BMP-1相關(guān)[24]。

BMP-4是BMP家族的另一個成員，對BMSCs生長調(diào)節(jié)、分化和存活起關(guān)鍵作用[25]。BMP-4是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中重要的形成蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，BMP-4也參與成骨，lncRNA母系表述基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)過表達(dá)可通過靶向調(diào)控BMP-4轉(zhuǎn)錄促進(jìn)BMSCs成骨分化，位于BMP-4基因附近的MEG3可以使轉(zhuǎn)錄因子SOX2(SRY related HMG box-2)與BMP-4啟動子解離，從而影響細(xì)胞成骨，提示lncRNA MEG3的表達(dá)可以為治療多發(fā)性骨髓瘤提供新的證據(jù)[26]。

2.2Runx蛋白家族與lncRNA Runx2屬于Runx蛋白家族，是一種能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化和成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨修復(fù)與重建中發(fā)揮重要作用[27]。使用lncRNA芯片分析糖皮質(zhì)激素處理的BMSCs中l(wèi)ncRNA TCONS_00041960的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TCONS_00041960的上調(diào)促進(jìn)了成骨基因Runx2的表達(dá)[28]。Zhuang等[29]對來自健康供體和青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者的BMSCs進(jìn)行微陣列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一種新的lncAIS(基因符號：ENST00000453347)與AIS患者BMSCs成骨有關(guān)，AIS BMSCs中的lncAIS下調(diào)不能募集核因子蛋白90，且消除了同源異形盒D8(homeobox gene D8，HOXD8)信使RNA的穩(wěn)定性，阻礙了Runx2轉(zhuǎn)錄，阻止了細(xì)胞成骨分化。Cui等[30]用不同濃度的葡萄球菌蛋白A對人BMSCs進(jìn)行處理，模擬體外炎癥微環(huán)境，使用lncRNA微陣列分析在葡萄球菌蛋白A觸發(fā)的炎癥微環(huán)境中BMSCs成骨分化期間lncRNA和信使RNA的完整表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用NONHSAT009968慢病毒感染來沉默BMSCs中NONHSAT009968的表達(dá)，Runx2的活性增加，表明lncRNA NONHSAT009968可能是促進(jìn)成骨細(xì)胞形成的新靶點。

2.3Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號通路與lncRNA lncRNA可以通過調(diào)節(jié)信號通路激活BMSCs調(diào)節(jié)成骨。Wnt/β-catenin信號網(wǎng)絡(luò)與干細(xì)胞自我更新和分化密切相關(guān)，可以控制干細(xì)胞的命運[31-32]。lncRNA肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(highly up-reglated in liver cancer，HULC)是各種人類疾病發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，通過轉(zhuǎn)染改變BMSCs中HULC和miR-195的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HULC過表達(dá)可下調(diào)miR-195，增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)[33]。lncRNA-p21與Wnt/β-catenin也密切相關(guān)，Xia等[34]從8周齡和18個月大的雄性C57BL/6小鼠中分離出BMSCs，發(fā)現(xiàn)沉默老齡小鼠BMSCs中的lncRNA-p21后，通過Wnt/β-catenin途徑相互作用可以提高老齡化小鼠的BMSCs成骨能力。提示靶向調(diào)控lncRNA-p21可能對恢復(fù)老年個體中的內(nèi)源性MSC具有重要的治療意義。另一項研究抑制了腫瘤低表達(dá)lncRNA(low expression in tumor，LET)，結(jié)果促進(jìn)了BMSCs增殖，LET可負(fù)調(diào)控BMSCs中TGF-β1的表達(dá)，小濃度的TGF-β1通過激活Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)BMSCs的增殖[35]。因此，可通過抑制LET上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin途徑，促進(jìn)BMSCs增殖[32]。含BED型鋅指蛋白3(zinc finger BED-type containing 3，ZBED3)是MSC中表達(dá)最高的lncRNA之一，具有促進(jìn)骨形成分化的能力。Hu等[36]成功建立了骨損傷模型，結(jié)果顯示，上調(diào)的ZBED3通過激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑降低白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs的分化和增強(qiáng)骨再生。這些研究從不同層面驗證了lncRNA參與了BMSCs的成骨分化，同時激活或抑制成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.4TGF-β與lncRNA TGF-β是BMP超家族成員之一，在骨基質(zhì)中高表達(dá)，與成骨細(xì)胞分化和骨發(fā)育密切相關(guān)，TGF-β對體外多種細(xì)胞的增殖和分化具有顯著影響，對骨吸收具有復(fù)雜的作用，可抑制破骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞活性[37]。SIRT1(sirtuin 1)能夠使β-catenin去乙?；源龠M(jìn)其在細(xì)胞核中的積累，這與BMSCs分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)；此外，SIRT1在BMSCs向成骨細(xì)胞的分化中起關(guān)鍵作用，SIRT1激活及抑制化合物可分別增加和減少成骨細(xì)胞標(biāo)志物和骨礦化的表達(dá)，提示SIRT1表達(dá)的變化與成骨細(xì)胞分化有關(guān)；而且，TGF-β配體激活TGF-β受體啟動Smad3信號，Smad3信號又可以協(xié)同激活SIRT1轉(zhuǎn)錄[38]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)是在缺氧感受與缺氧誘導(dǎo)方面發(fā)揮重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，Xu等[39]研究人BMSCs中l(wèi)ncRNA HIF-1α成骨細(xì)胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β可抑制BMSCs中SIRT1的表達(dá)，低水平的SIRT1導(dǎo)致lncRNA HIF-1α上調(diào)，相反SIRT1的過表達(dá)導(dǎo)致lncRNA HIF-1α-AS1下調(diào)，通過促進(jìn)乙酰化來增強(qiáng)同源異形盒D10(homeobox gene D10，HOXD10)的表達(dá)，而HOXD10表達(dá)在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化中起重要作用，因此TGF-β通過SIRT1和lncRNA HIF-1α-AS1導(dǎo)致BMSCs分化為成骨細(xì)胞。提示HIF-1α-AS1是成骨細(xì)胞分化的重要介質(zhì)，并因此可以作為基因治療劑用于人骨疾病的治療。另外，lncRNA H19也與骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松息息相關(guān)，Huang等[40]發(fā)現(xiàn)，人BMSCs成骨分化后lncRNA H19顯著上調(diào)，H19可協(xié)調(diào)miR-675抑制TGF-β1信使RNA和蛋白的表達(dá)，而TGF-β1下調(diào)后可抑制Smad3磷酸化，該研究發(fā)現(xiàn)了一條新途徑，即H19/miR-675/TGF-β1/Smad3/組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)途徑，調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化。lncRNA H19作為競爭性內(nèi)源RNA還可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑，這也揭示了lncRNA在協(xié)調(diào)骨生成中的作用[41]。

2.5促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號與lncRNA MAPK家族調(diào)控BMSCs的分化、礦化和增殖[42]。p38是MAPK通路的成員之一，是調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、死亡等多種過程的重要調(diào)控因子[43]。目前已有研究證實，p38 MAPK信號通路的激活是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵觸發(fā)因子[44]。Zhang等[45]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA分化拮抗非蛋白編碼RNA(discrimination antagonising non-protein coding RNA，DANCR)參與了人來源的BMSCs的成骨分化，DANCR通過p38 MAPK通路調(diào)控增殖和成骨分化；為了闡明p38 MAPK對DANCR相關(guān)細(xì)胞增殖和成骨分化的影響，將轉(zhuǎn)染si-DANCR的BMSCs用特異性p38抑制劑SB203580處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DANCR上調(diào)導(dǎo)致p38 MAPK通路失活，DANCR與MAPK通路的關(guān)聯(lián)可能為骨形成分化調(diào)控機(jī)制提供新的見解。

骨質(zhì)疏松癥是一種嚴(yán)重的慢性系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松疾病，其特征在于低骨密度(bone mineral density，BMD)和結(jié)構(gòu)障礙。研究表明，BMSCs的異常分化是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的最根本原因，骨質(zhì)疏松癥患者BMD低表達(dá)和β-Ⅰ型膠原羧基端肽(β-carboxyl terminal peptide of typeⅠcollagen，β-CTx)高表達(dá)[46]。Jiang等[47]通過實驗創(chuàng)建小鼠骨質(zhì)疏松模型，測量小鼠脊柱的BMD、血清β-CTX水平和ALP活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMD降低，β-CTx和核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)表達(dá)增加。在成骨誘導(dǎo)劑刺激的BMSCs中，ALP活性和磷酸化p38蛋白水平升高，SNHG1表達(dá)下調(diào)；同時SNHG1過表達(dá)增強(qiáng)了神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子4(neural precursor cell down-regulation factor 4，NEDD4)和磷酸化p38之間的相互作用，破壞了磷酸化p38的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并促進(jìn)了磷酸化p38的泛素化，而泛素化又是一種重要的翻譯后調(diào)控機(jī)制，由泛素-活化酶(E1)、泛素綴合酶(E2)和泛素-連接酶(E3)介導(dǎo)[48]。已經(jīng)證實，E3家族成員在成骨分化中發(fā)揮重要作用[49]。在E3泛素連接酶中，Nedd4可通過介導(dǎo)泛素化和降解骨肉瘤細(xì)胞抑制p38活化[50]。Jiang等[47]的實驗證明，lncRNA SNHG1通過Nedd4介導(dǎo)的泛素化負(fù)向調(diào)節(jié)p38 MAPK信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而抑制BMSCs的成骨分化。Zheng等[51]也成功建立了SD大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過即時聚合酶鏈反應(yīng)檢測lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在骨質(zhì)疏松大鼠和正常大鼠中的表達(dá)，培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染BMSCs以建立MALAT1敲低模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在骨質(zhì)疏松大鼠中低表達(dá)；此外，lncRNA MALAT1通過增強(qiáng)MAPK信號通路的激活來抑制BMSCs的成骨分化，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程。這些研究均表明lncRNA參與MAPK通路，從而影響B(tài)MSCs的成骨過程。

3 小 結(jié)

lncRNA在發(fā)育和分化過程中對基因表達(dá)的控制起著至關(guān)重要的作用。與miRNA不同，lncRNA可以折疊成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)和高階結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)和目標(biāo)識別提供更大的潛力和通用性。多種lncRNA參與了BMSCs的成骨分化，lncRNA在調(diào)節(jié)BMSCs增殖方面顯示出令人鼓舞的趨勢，而且這些lncRNA與各種骨疾病有著不可分割的關(guān)系。通過闡述lncRNA相關(guān)的重要的成骨相關(guān)因子和信號通路，證明了lncRNA與BMSCs的成骨相關(guān)，而且這些lncRNA也與骨相關(guān)疾病密切相關(guān)。然而，lncRNA參與BMSCs病理過程中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制，還需要進(jìn)行深入的研究。