楊麗可,孫亞男

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，哈爾濱 150001)

頭頸部腫瘤是人類常見的腫瘤之一，其發(fā)病率在所有腫瘤中居第六位。頭頸部腫瘤會降低患者生活質量，并產(chǎn)生巨大的社會負擔，吸煙、飲酒和人乳頭瘤病毒感染，是最常見的危險因素。近5年，盡管腫瘤的治療方面取得了一定進展，但頭頸部腫瘤患者的生存率仍為50%，許多頭頸部腫瘤患者在診斷時腫瘤已轉移，但目前沒有可用于監(jiān)測早期頭頸部腫瘤患者局部復發(fā)或遠處轉移的工具[1-2]。因此，尋找可以識別患者腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移的生物標志物尤為重要。多種類型的RNA，包括長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)和微RNA(microRNA，miRNA)參與調節(jié)哺乳動物細胞中各信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表達水平可為新型腫瘤標志物的研究提供新的角度[3]。研究表明，幾種circRNA通過miRNA或蛋白質參與調節(jié)糖類、脂質及氨基酸的代謝，說明circRNA是非編碼RNA調控網(wǎng)絡的一部分[4]?，F(xiàn)通過總結與頭頸部腫瘤相關的人類circRNA文獻，探討近年國內(nèi)外關于circRNA與腫瘤增殖、侵襲等的關系，對circRNA的結構、特征、作用、發(fā)生機制及與頭頸部腫瘤治療方向的潛在價值等予以綜述。

1 circRNA的結構、特征、作用及發(fā)生機制

1.1circRNA的結構及特征 circRNA由單個RNA分子末端共價形成，無5′及3′核糖核苷酸末端結構，細胞中circRNA豐富、保守、穩(wěn)定，并且表具有時空特異性。

1.1.1豐富性 隨著科技的進步與觀念的更新，人類通過基因組學找到了更多關于circRNA存在的證據(jù)。Salzman等[5]鑒定了2 000例人類、1 900例老鼠以及700例線蟲的circRNA測序資料，證實了50種circRNA的存在，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)正常細胞與腫瘤細胞中均有circRNA表達。Jeck和Sharpless[6]發(fā)現(xiàn)大約1/8的表達基因可產(chǎn)生circRNA，而且環(huán)狀分子的豐度是相關線性mRNA的10倍以上。Memczak等[3]也在大量研究中發(fā)現(xiàn)，不同細胞類型和發(fā)育階段也存在大量circRNA特異性表達。因此，circRNA的研究有據(jù)可循。

1.1.2高度保守性 內(nèi)含子形成的circRNA通過2′,5′-磷酸二酯鍵連接首尾兩端，而外顯子形成的circRNA則通過3′,5′-磷酸二酯鍵首尾相連接，說明特殊的反向剪接具有高度的保守性。研究發(fā)現(xiàn)，人類成纖維細胞中的457circRNA可與小鼠的circRNA匹配，相同的circRNA可表達于腦、睪丸、胃、肝、腎，甚至大多數(shù)circRNA橫貫了真核生物的一生，circRNA在真核基因中表現(xiàn)出古老、保守的特性，因此在不斷變化的分子生物學研究中，這一特性成了一個標桿[7-9]。

1.1.3穩(wěn)定性 circRNA在細胞質中可以抵抗脫支酶和RNA核酸外切酶降解，因而可以穩(wěn)定存在于細胞質中，使研究過程更加平穩(wěn)有序、降低了探索過程中的不確定性、提高了得出實驗結果的可能[5]。

1.1.4時空特異性 circRNA在同一生物的不同發(fā)育階段、同一發(fā)育階段的不同部位均表現(xiàn)出表達差異性[3,5,10]。這樣的差異豐富了生物多樣性，揭示了分子生物學的研究中生物機體運轉的高效性。

1.2circRNA的作用 circRNA的生物作用包括5個方面：海綿效應、轉錄后調節(jié)、環(huán)形翻譯、circRNA介導的擬基因以及干擾剪接，circRNA的位置、結合位點、表達方式不同[11]。①海綿效應：circRNA的超級海綿被認為是一種新的競爭性內(nèi)源RNA，可通過互補堿基配對海綿化并抑制相關miRNA。②轉錄后調節(jié)：轉錄后調控細胞核中大多數(shù)circRNA(由內(nèi)含子形成)位點幾乎沒有miRNA結合功能，但敲低circRNA會阻礙相應基因的轉錄[12]。③環(huán)形翻譯：如果circRNA包含直接與核糖體結合的內(nèi)部核糖體進入位點序列，則已證明可以在真核細胞中翻譯[13-15]。④circRNA介導的擬基因：在研究circRNA的過程中，應注意circRNA衍生的擬基因對實驗結果的干擾，circRNA衍生的擬基因暗示了circRNA通過逆轉轉座對宿主基因組的影響[11]。⑤干擾剪接：環(huán)化過程影響選擇性剪接circRNA通常被認為是源自蛋白質編碼基因剪接過程的獨特功能性副產(chǎn)物，目前鑒定出的大部分circRNA由外顯子衍生，因此此類circRNA的形成過程可能會影響相關前體mRNA的選擇性剪接，從而導致基因表達改變。

1.3circRNA的發(fā)生機制 circRNA不同于線性RNA的剪接，包括外顯子套索環(huán)化和內(nèi)含子配對環(huán)化[16]。

1.3.1circRNA的外顯子套索環(huán)化 外顯子套索環(huán)化的形成機制為直接反向剪接和外顯子跳讀[17]。直接反向剪接是通過外顯子上游的5′頭與外顯子下游的3′尾配對，外顯子環(huán)化形成circRNA，外顯子跳讀是指內(nèi)含子跳讀形成的套索，隨著包含相應的外顯子套索內(nèi)部的拼接，多余的內(nèi)含子被切除形成circRNA。

1.3.2circRNA的內(nèi)含子配對環(huán)化 內(nèi)含子有3種不同的剪接方式：自我剪接、酶促剪接以及核mRNA前體剪接。這3種剪接方式均為前體mRNA中的2個內(nèi)含子通過堿基互補配對形成套索，再切除內(nèi)含子，然后形成circRNA。

2 circRNA與腫瘤的關系

2.1circRNA與鼻腔鼻竇惡性腫瘤 雖然鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，但在各種解剖學亞位點的相對發(fā)病率各不相同。相對于頭頸部其他部位的鱗狀細胞癌百分比(65%～70%)，鼻腔鼻竇的鱗狀細胞癌占比相對較小，僅占頭頸部鱗狀細胞癌的3%～5%[18]。鼻腔鼻竇鱗狀細胞癌具有高度惡性，加之位置隱蔽、早期癥狀不明顯，在臨床中往往預后不良。鼻腔鼻竇惡性腫瘤病理類型主要包括嗅神經(jīng)母細胞瘤、鱗狀細胞癌、腺癌、未分化癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、惡性黑色素瘤、腺樣囊性癌、血管周細胞瘤、淋巴瘤和軟組織肉瘤等[19]。上頜竇腫瘤早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)引起一定程度的破壞，如已經(jīng)侵犯竇腔的骨質或周圍組織，當這種腫瘤被局限于竇腔時，遠處轉移并不常見，但當侵犯面部、面部皮膚、翼腭窩、口周豐富的軟組織時，轉移到局部或遠處淋巴結的情況比較常見。上頜竇腫瘤的治療多采取手術治療、放療和化療，沒有分子水平上的治療，且現(xiàn)有研究并沒有發(fā)現(xiàn)與鼻腔鼻竇惡性腫瘤相關的具體circRNA，也沒有確切提出功能及作用，因此尋找相關的circRNA尤其重要。

2.2circRNA在鼻咽癌的發(fā)展和侵襲中的作用 鼻咽癌是與EB病毒相關的頭頸部腫瘤，具有種族差異和地域分布差異，主要發(fā)生于東亞、東南亞及北非國家[20]。而在中國，鼻咽癌是中國南方地區(qū)最常見的頭頸部惡性上皮腫瘤，是嚴重影響人類生活質量的一種惡性腫瘤[21-22]。鼻咽癌的傳統(tǒng)治療大多以放療為主聯(lián)合化療及靶向治療，但術后復發(fā)率較高，并會出現(xiàn)放療后出血等一系列并發(fā)癥，且患者5年生存率為70%[23]。Wei等[24]通過反轉錄-定量聚合酶鏈反應和熒光素酶報告實驗評估circ_0008450的機制，結果顯示circ_0008450在鼻咽癌組織和細胞中升高，沉默的circ_0008450可以抑制細胞增殖和轉移的特性并增加凋亡細胞數(shù)量，異位表達circ_0008450加強了惡性生物學行為，且circ_0008450減少了miR-577介導的趨化因子配體9抑制，促進了鼻咽癌的發(fā)生?？傊?，circ_0008450通過調節(jié)miR-577/趨化因子配體9信號轉導在鼻咽癌細胞中充當致癌基因。Zhu等[25]研究表明，高表達的circ-ZNF609吸附miR-150-5p上調特異性β1糖蛋白表達，從而促進鼻咽癌細胞的增殖和轉移能力。Shuai等[26]進行實時定量熒光聚合酶鏈反應以測定鼻咽癌和鄰近組織中circRNA_100783、circRNA_0000285和circRNA_100782的水平，并在鼻咽癌患者和健康對照人群的血清樣品中進一步證實了circRNA_0000285水平，研究顯示與健康對照組的鄰近組織和血清樣品相比，鼻咽癌患者的腫瘤組織和血清樣品中circRNA_0000285顯著增加。因此，circRNA_0000285可能是鼻咽癌一種新的生物標志物，參與鼻咽癌的放射敏感性。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近組織相比，在鼻咽癌組織中circRNA_000543表達上調，且放射抗性樣品中的表達量較放射敏感性鼻咽癌組織樣品中更高，與低 circRNA_000543患者相比，高circRNA_000543表達鼻咽癌患者的總體生存率較差，進一步研究表明，circRNA_000543通過靶向miR-9/血小板衍生生長因子受體B軸沉默circRNA_000543，提高鼻咽癌細胞對輻射的敏感性，說明circRNA_000543可能是鼻咽癌抗輻射的潛在靶標。以上相關標志物高表達時均有強烈的致癌傾向，有助于新的腫瘤標志物的選擇。

2.3circRNA與口腔癌的發(fā)展和侵襲中的作用 口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見、危害最嚴重的惡性腫瘤之一?？谇话┦且环N多因素腫瘤，缺乏有效和準確的治療、診斷工具，因此需要尋找用于及時檢測和患者分層的可靠生物標志物。circRNA是各種癌癥的生理和病理過程中的關鍵因素，也反映了口腔癌的發(fā)展和進展。

2.3.1circRNA在口腔癌細胞及組織中的表達 Li等[28]研究表明，has_circ_0008309在45組口腔癌樣本中顯著下調，并且在病理變異上有相關性。除此之外，Su等[29]發(fā)現(xiàn)，與成對的非癌癥匹配組織相比，OSCC組織中hsa_circ_0005379的表達顯著降低，并且與腫瘤大小和分化相關。hsa_circ_0005379的過表達有效抑制了體外OSCC細胞的遷移、侵襲和增殖，并抑制了體內(nèi)裸鼠OSCC的生長，研究表明，hsa_circ_0005379可能參與表皮生長因子受體通路的調控，此外，研究還發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005379的高表達可以顯著增強OSCC對西妥昔單抗藥物的敏感性。Ouyang等[30]經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，has_circ_0109291在OSCC組織與其他細胞系的組織相比有明顯提高，并且高表達的has_circ_0109291往往預后更差，這說明此RNA可能成為OCSS治療的新靶點。另有研究顯示hsa_circ_001242在OSCC中表達下降，并且可以作為診斷和治療OSCC的潛在新型生物標志物[31]。Zhao等[32]通過大量臨床樣本發(fā)現(xiàn)，與健康對照人群的唾液相比，OSCC患者的唾液中有12種上調和20種下調circRNA，在差異表達的circRNA中，hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971和hsa_circ_0008068上調，與健康組相比，OSCC組hsa_circ_0000140、hsa_circ_0002632和hsa_circ_0008792下調，這是第一項證明唾液hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971作為診斷OSCC的生物標志物的潛力的研究。在OSCC的circRNA的研究中，上調下調的circRNA均有體現(xiàn)，因此規(guī)范腫瘤標志物的類型及探索方向的調整尤為重要。

2.3.2circRNA與口腔癌相關機制 hsa_circ_0007059可通過蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路改變細胞生長，是OSCC潛在的預后(或治療)靶點[33]。Chen等[34]研究表明，沉默circRNA_100290可顯著降低細胞增殖速度，抑制細胞遷移和侵襲能力，但會促進細胞凋亡。在口腔癌中，circRNA_100290在miR-29家族中發(fā)揮海綿作用。circRNA_100290可充當內(nèi)源競爭RNA以抵消miR-378a介導的葡萄糖轉運子1抑制，從而促進OSCC中的糖酵解和細胞增殖[35]。上述研究表明circRNA在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，提示了口腔癌復雜的機制，參與了癌癥不同表型，如增殖、凋亡、侵襲等。

2.4circRNA與喉癌發(fā)展及侵襲中的作用 喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，治療包括手術治療、放療及化療，但患者5年生存率仍然不盡如人意。circRNA研究中，F(xiàn)an等[36]研究表明，LSCC組織中hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529顯著上調，hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529最可能潛在的靶miRNA分別為hsa-miR-4726-5p和hsa-miR-4640-5p，功能分析顯示，hsa_circ_0044520和hsa_circ_0044529參與了膠原蛋白的合成過程。Wu等[37]認為，circRNA hg19_circ_0005033可促進喉癌干細胞的增殖、遷移、侵襲和化療耐藥。Tian等[38]研究發(fā)現(xiàn)，circRASSF2在LSCC組織和LSCC細胞系中與成對的相鄰非腫瘤組織和正常細胞相比顯著上調。此外，敲除circRASSF2可顯著抑制體外細胞增殖和遷移，miR-302b-3p抑制劑可阻斷細胞增殖和遷移。綜上，通過與miR-302b-3p相互作用并減少抑制素樣生長因子1受體表達，可使circRASSF2沉默抑制LSCC的進展。

目前并沒有明確、可應用于臨床的新型標志物，也沒有能夠體現(xiàn)腫瘤發(fā)展的不同階段的測試方法，在擁有先進醫(yī)療保健系統(tǒng)的國家，喉癌的病死率正在下降，但相關并發(fā)癥如咳嗽、聲音嘶啞、吞咽困難和呼吸困難，仍然給患者帶來巨大痛苦。因此，闡明重要的分子發(fā)病機制將對潛在的喉癌具有重要意義。

3 circRNA是潛在的頭頸部腫瘤的靶點

circRNA活躍于人體細胞生長發(fā)育的許多信號通路中。circRNA對上皮-間充質轉化調節(jié)起到了重要作用，而腫瘤的轉移則與上皮-間充質轉化具有極大的相關性。在上皮-間充質轉化的過程中，上皮細胞失去特征，例如細胞間黏附和細胞極性的喪失，細胞獲得運動性，并且遷移病情，如成為間質干細胞。實驗表明，circRNA與腫瘤的轉移與患者的預后密切相關，且證明了轉化生長因子-β/Smad途徑是各種癌癥類型的生長和轉移中的正調節(jié)劑[39]。因此，腫瘤細胞的轉移可以通過檢測癌旁組織中的circRNA的變化預測和鑒別。目前的分析表明，circRNA的高表達與人類癌癥的臨床病理和預后之間存在明顯關聯(lián)，有希望成為癌癥的生物標志物和治療靶標[40]。盡管如此，仍需更多采用標準化方法的大規(guī)模研究為circRNA的預后價值提供新的見解。

circRNA也有一些診斷的缺點。首先，一些circRNA的存在需要患者的病理組織進行鑒別與診斷，屬于有創(chuàng)操作，增加了感染與轉移的風險。其次，檢測組織或外泌體中circRNA的臨床及常規(guī)實驗室檢查較昂貴，限制了生物標志物circRNA的臨床應用。circRNA進行診斷的可靠性仍然需要大量的實驗與臨床試驗結果及病例證明。此外，由于大量的circRNA，它們的功能復雜并且不同。目前的研究主要集中在RNA與蛋白質之間的關系，但circRNA二級結構的功能及其在DNA基因組中的作用仍然需不斷探索。

4 小 結

circRNA是近年來基因遺傳學的重大發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療與預防提供了新的研究思路，并且circRNA的高度組織特異性及穩(wěn)定性使其具備了作為新型生物標志物的條件。大量研究結果表明circRNA在腫瘤中顯著表達，并且許多途徑可以影響腫瘤的發(fā)展。雖然已有許多研究證實了circRNA在生理和病理過程方面的生物學功能，以及circRNA在喉癌中扮演癌基因的功能，但是具體機制需要在今后的研究中進一步揭示。然而，circRNA能否真正作為一個喉癌的分子標志物，還需要更多大樣本的實驗證實，并且仍有很多的未知領域需要探索以及辨證，以便應用于臨床。