周晨明 朱 艷 孟 麗 閆 靜 徐彥楠

河北醫(yī)科大學 1 電鏡實驗中心 2 教學實驗中心，河北省石家莊市 050017

電子顯微鏡技術廣泛應用于科研和醫(yī)療中，在日常的工作過程中經常會出現(xiàn)學生送的標本因取材或固定不當而影響最終超微結構的觀察。取材固定是電鏡樣品制備的第一步，也是最關鍵的一步，直接影響觀察結果。所以在此筆者對經常出現(xiàn)的問題進行分析總結。

1 取材前的準備工作

1.1 實驗設計 大量閱讀文獻，明確實驗目的，設計實驗流程，合理安排取材時機[1]。戊二醛影響抗原性，若課題需要做免疫性的實驗，就必須每組單獨準備一只做電鏡的動物。對于未進行灌流固定的動物最好先進行電鏡標本的取材，以免組織自溶，影響超微結構的觀察。實驗動物要避免刺激以及環(huán)境的改變，盡量保持其生理狀態(tài)，增加實驗的可比性和可靠性[2]。取材時，務必做到相同條件下取材，相同人員平行操作，分別平行取每一組相同序號的動物[3]。一般每組動物至少取3份標本，避免個體差異，增加結論的可靠性。

1.2 固定液的選擇 固定的作用是在分子水平上使細胞保存生活狀態(tài)的超微結構，減少細胞死后的變化?；瘜W固定劑可以和蛋白質結合形成交聯(lián)，將蛋白質固定下來，也可以將糖、脂肪等物質保存在生存時的狀態(tài)和位置，因此固定液的選擇極為重要。

取材后固定的操作由學生進行，固定液的選擇至關重要。一般細胞固定液為2.5%的戊二醛，組織固定液為4%的戊二醛，灌流固定選用3%多聚甲醛1%戊二醛，固定液應為清澈透明的液體，若見白色渾濁或絮狀物則固定液不合格，影響最后的固定效果。固定液的酸堿度可以引起組織pH值的變化，不僅可以從根本上改變蛋白質等大分子物質的結構和性質，而且還會影響細胞質的化學成分、膜的大分子排列及酶的生物活性，所以固定液的酸堿度必須與被固定的組織酸堿度基本一致[4]。大多數(shù)動物組織酸堿度的平均值是7.4，所以固定液的pH值必須在7.2～7.4之間。

1.3 實驗器械、標本固定容器的準備 固定組織的容器最好為青霉素小瓶，不宜使用Eppendorf 管，因為青霉素小瓶的底面比較大，組織可以充分地與固定液進行接觸，固定效果更好。對取材用器材及試劑，進行清潔及預冷，寫好取材的標簽。

2 取材

2.1 正常對照組的取材 正常對照組應與模型組、治療組同時取材。在工作中經常出現(xiàn)先用空白對照組進行練手，以致其結構變化，最終導致無法作為正常對照組。

2.2 組織標本的取材原則 組織標本的取材遵循快、小、輕、準、冷五原則?？欤阂蠼M織在斷血1min內浸入固定液。取材時間過長，會出現(xiàn)細胞內溶酶體膜破裂，組織自溶。在操作過程中必須目標明確動作迅速，若多部位取材，須多人配合。?。簺]有方向的組織一般為取材尺寸為1mm×1mm×1mm，有方向的組織為1mm×1mm×3mm為宜，3mm為長軸的方向。因為固定液的穿透能力只有0.5mm，若樣品過大會使內部固定不良；但也不能太小，樣品過小時觀察的目標將受到局限。輕：取材刀片要鋒利，多選用雙面剃須刀片，操作應始終貫徹動作輕柔。只做直線切割，避免對組織的擠壓及拉鋸，以免引起的組織結構的人工損傷性變化。準：部位準確可靠，根據(jù)研究目的要考慮到定位和定向的問題。冷：低溫下操作，低溫下保存，低溫下送樣。為了降低水解酶的活性，盡量在低溫下操作，所用容器和器械應預冷，取好的標本放在4℃冰箱保存。送樣時最好放到冰盒里，但應注意在小瓶與冰之間應用紗布隔開，以免固定液結冰，破壞細胞結構。

2.3 取材具體操作 將動物急性處死(或麻醉)，暴露出所需要的器官，用鋒利的解剖剪剪取一小塊組織，放在預先預冷的4%戊二醛固定液中。然后取出放在下面鋪有冰袋的蠟板上，滴1滴預冷的固定液，用雙面刀片將材料切成大約1mm寬，2～3mm長的小條，剪刀剪過的部位盡量不保留，對于沒有定向要求的標本再將其切成約的1mm3小塊。最后用牙簽將組織塊逐一放入固定液的小瓶中。放入4℃冰箱，固定2～4h。若不能及時往電鏡室送樣，每周更換固定液，放置最好不要超過2周。

2.4 特殊部位的取材 腦：因對缺氧比較敏感，所以最好先進行灌流固定，待組織硬化后進行取材。視網膜：常規(guī)的取材方法易造成視網膜組織脫離、皺褶，不符合電鏡觀察的要求。應該灌流固定后取整個眼球，將角膜剪開用注射器注入固定液，再將整個眼球放入固定液中固定。管狀組織：取1cm左右的一段，再將兩端上翻的組織用雙面刀片去除，再進行固定。睪丸：因白膜下均為精曲小管，若取材太小則容易散開，所以取材應大一點，待固定一段時間后再進行修塊，去除白膜，取白膜下的部分再進行固定。胰島：若觀察胰島，取材應在胰腺的胰尾部。肺：因肺密度較小，固定時經常漂在上面，可以用小紗布將其包裹，再放入固定液中即可下沉。腎：若觀察腎小球，應選擇腎皮質部位進行取材。

2.5 培養(yǎng)細胞的取材固定 收集細胞的數(shù)量因細胞體積的大小而定，一般(2～5)×106即可。收集懸浮細胞時，將含有細胞的培養(yǎng)液倒入離心管，進行離心。貼壁細胞先將細胞從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿上輕輕地刮下來或者用胰酶消化下來，收集到離心管中離心。如果觀察細胞凋亡，則應注意凋亡細胞或凋亡小體主要漂浮在培養(yǎng)液中，在收集樣品過程中不能將培養(yǎng)液全部棄掉，應該將刮下的細胞和培養(yǎng)液中的細胞一同離心固定[5]。若僅保留貼壁細胞，將很難找到理想的凋亡細胞。

為了獲得更理想的超微結構，可在離心前加入等量的2.5%的戊二醛，再進行離心。不同細胞離心轉速和時間不同，應查閱文獻進行確定。棄上清后沿管壁緩慢加入固定液，在4℃冰箱內靜置固定1～2h，然后送樣。若固定后，在送樣時又散開，且再次離心不易成團，可以棄固定液，加入小滴10%牛血清白蛋白，再離心成團，再棄上清加固定液送樣。

3 討論

在多年電鏡工作中發(fā)現(xiàn)，學生在做電鏡實驗中準備不充分，沒有閱讀文獻，對自己實驗目的不明確，前期實驗設計不合理、取材操作不規(guī)范，導致后續(xù)工作都是徒勞。所以，作為電鏡工作人員要做好前期的教學、幫助學生進行實驗設計、指導取材等工作。身為學生，在電鏡實驗過程中，務必做到虛心學習、多查、多問、多思考、多練習，以使實驗順利完成。