陳鳴，殷勇

(國家兒童醫(yī)學中心 上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心呼吸科，上海 200127)

細胞外囊泡是普遍存在于真核細胞及原核細胞中的一種脂質(zhì)雙分子密閉球形結(jié)構(gòu)[1]。Chargaff和West[2]于1946年首次在血漿中發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡，并認為其是血小板促凝血顆粒，Wolf[3]于1967年將其定義為“血小板粉塵”。但隨著研究的深入，學者發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡并不是簡單的細胞碎片，它的功能豐富，且多種細胞均具有分泌細胞外囊泡的特點[4]。根據(jù)分泌細胞的不同以及刺激因素的差異，所產(chǎn)生的細胞外囊泡結(jié)構(gòu)及功能也具有一定的異質(zhì)性。細菌的細胞外囊泡首次在大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)[5-6]。來自革蘭陰性菌的細胞外囊泡通常被稱為外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)，其已被證實可以攜帶多種物質(zhì)，包括細菌毒力因子、黏附素、核酸、免疫調(diào)節(jié)因子等。細胞外囊泡在分子傳輸、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，以及生物膜形成方面起重要作用。它可以將較高濃度的多種效應(yīng)分子運送到遠處，通過膜融合和(或)內(nèi)化將效應(yīng)分子傳遞至靶細胞內(nèi)；保護性地將對細菌生存不利的錯誤折疊蛋白、抗菌肽、補體等清除出細胞[7-8]；同時作為生物膜形成的重要成分，細胞外囊泡能保護細菌免受損害。而革蘭陽性菌由于為厚壁結(jié)構(gòu)且無細胞外膜，所以直到1990年，有關(guān)革蘭陽性菌的細胞外膜才被報道[9]，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肺炎鏈球菌、變形鏈球菌等陽性球菌均可以產(chǎn)生細胞外囊泡。起源于革蘭陽性菌的柔膜類細菌也被證實具有分泌細胞外囊泡的作用，并具有與OMV相似的生物學作用[10]。目前，已有將革蘭陰性微生物的囊泡開發(fā)成治療性疫苗的研究[11]。因此，全面了解細胞外囊泡的產(chǎn)生機制，可能有助于設(shè)計靶向細胞外囊泡產(chǎn)生過程的藥物和制造含有理想抗原的細胞外囊泡，以生產(chǎn)出更有效的疫苗?，F(xiàn)就原核生物胞外囊泡的生成與功能予以綜述。

1 細胞外囊泡的生成

1.1革蘭陰性菌 革蘭陰性菌具有兩層包膜，稱為外膜和內(nèi)膜。外膜是一種不對稱的雙側(cè)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，脂多糖是外葉中最豐富的脂質(zhì)。脂多糖由脂質(zhì)A、聚糖核心和稱為O抗原的長多糖側(cè)鏈構(gòu)成[12]。外膜與內(nèi)膜之間形成細菌的周質(zhì)空間，周質(zhì)是一種氧化環(huán)境，占總細胞體積的7%～40%[13]。周質(zhì)內(nèi)薄的、剛性的肽聚糖層，通過膜錨定蛋白質(zhì)連接到內(nèi)膜和外膜上。革蘭陰性菌通過產(chǎn)生直徑為20～250 nm的小球形結(jié)構(gòu)——OMV，釋放外膜和周質(zhì)。其機制如下。

1.1.1周質(zhì)空間壓力的增加 生理情況下，細胞壁在更新過程中，會在轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)之前，以低分子量肽聚糖片段存在于周質(zhì)中，而肽聚糖片段的積累可產(chǎn)生膨脹壓力使得外膜彎曲形成OMV。Hayashi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，自溶素活性降低的牙齦卟啉單胞菌細胞外囊泡分泌增加。作為細菌重要的胞壁質(zhì)水解酶，自溶素可切割肽聚糖中的共價鍵，負責細胞壁重構(gòu)、肽聚糖轉(zhuǎn)換、細胞分裂和肽聚糖細胞壁修復。自溶素的活性降低，導致細胞壁不能完全降解，細胞壁中間體的積累使得周質(zhì)空間壓力增加，從而引起外膜膨出。另有研究證明，囊泡釋放的數(shù)量與細胞包膜中錯誤折疊蛋白質(zhì)積累的水平直接相關(guān)，錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集在外膜的內(nèi)表面，在膜上產(chǎn)生壓力[15]。雖然以上研究從某些方面解釋了囊泡產(chǎn)生的機制，但理論上細菌的外膜可以承受3個大氣壓的膨脹壓力。因此，如果單純用周質(zhì)空間壓力增加，引起外膜膨出，從而導致OMV分泌增加，很難令人信服。在對細胞外囊泡成分的研究中，更多的證據(jù)表明細胞外囊泡內(nèi)物質(zhì)的包裹是主動選擇的結(jié)果[16-18]。因此，囊泡內(nèi)肽聚糖片段或錯誤折疊蛋白的富集，也可能是細胞自身防御、抵抗的主動選擇。

1.1.2外膜與肽聚糖交聯(lián)減少 革蘭陰性菌外膜與肽聚糖的交聯(lián)，對于維持外膜的穩(wěn)定十分重要。而肽聚糖相關(guān)脂蛋白、胞壁蛋白脂蛋白A和外膜蛋白A是革蘭陰性菌外膜與肽聚糖之間的重要交聯(lián)蛋白。當交聯(lián)蛋白減少時，OMV的產(chǎn)生增加，反之亦然。在相同的刺激下，一些脂蛋白、肽聚糖層相關(guān)交聯(lián)蛋白的基因突變株均表現(xiàn)細胞外囊泡較野生株分泌增多的現(xiàn)象[19-20]。這表明，細胞外囊泡更傾向于在外膜與肽聚糖交聯(lián)減少處分泌，同時也解釋了具有更低脂蛋白水平的銅綠假單胞菌較大腸埃希菌外膜可以產(chǎn)生更多OMV的現(xiàn)象[21]。然而，由于一些突變株在檢測細胞外囊泡的同時顯示出細胞內(nèi)組分的大量滲漏，因此不能排除一些囊泡的增加可能是由細胞裂解引起。如果僅是減少外膜與肽聚糖的交聯(lián)，不能使外膜膨出囊泡化，所以可能在交聯(lián)減少、囊泡化概率增加的情況下，同時聯(lián)合了周質(zhì)空間增加的膨出壓，從而共同導致外膜的囊泡化。

1.1.3膜曲率誘導分子的富集 作為周質(zhì)空間壓力增加的替代或補充，曲率誘導分子可引起膜膨脹。脂多糖是革蘭陰性菌外膜外表面的主要脂質(zhì)，其由脂質(zhì)A、核心寡糖和O-多糖側(cè)鏈組成；核心寡糖和O-多糖側(cè)鏈與脂質(zhì)A連接從細菌向外延伸。雖然當pH值為7時脂多糖基團呈電離狀態(tài)，但它們可以與Mg2+和Ca2+結(jié)合形成鹽橋，使相鄰的脂多糖分子鹽結(jié)合在一起，從而維持外膜的穩(wěn)定[22]。銅綠假單胞菌能夠合成兩種類型的脂多糖，分別為A帶脂多糖和B帶脂多糖，兩者的區(qū)別在于O-多糖側(cè)鏈組成不同：A帶脂多糖的側(cè)鏈不帶電，B帶脂多糖側(cè)鏈帶明顯的負電荷。其中，銅綠假單胞菌OMV主要含有B帶脂多糖，而外膜包含A帶脂多糖和B帶脂多糖，B帶脂多糖為次要外膜成分。外膜如果具有過多帶負電荷的B帶脂多糖，會造成陰離子間的排斥反應(yīng)，影響外膜穩(wěn)定，從而導致外膜曲率增加。而細菌通過分泌主要含有B帶脂多糖的細胞外囊泡，可能是其維持膜穩(wěn)定的一種方式。有關(guān)銅綠假單胞菌喹諾酮信號(pseudomonas quinolone signal,PQS)刺激囊泡產(chǎn)生的研究證明了這一觀點。研究發(fā)現(xiàn)，PQS插入外膜外葉中可刺激細胞外囊泡的形成及自身的包裝和運輸，其機制為PQS可以與二價陽離子結(jié)合，增加脂多糖間的陰離子排斥，引起細胞外膜膨出[23-24]。而誘導細胞外囊泡形成的慶大霉素也具有相似的機制[25]。脂質(zhì)A中的?；湐?shù)量影響了分子傾斜至膜的角度，故減少脂質(zhì)A中的酰基數(shù)量會減小分子的疏水截面積，將其從圓錐形變?yōu)閳A柱形或倒置的圓錐形，從而改變細菌外膜曲率。Elhenawy等[26]研究發(fā)現(xiàn)，脫?；|(zhì)A的增加，可以引起細菌分泌細胞外囊泡的數(shù)量增加，且在分泌的OMV中檢測到了脫?；|(zhì)A的富集。而Roier等[16]的研究發(fā)現(xiàn)VacJ/Yrb ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)系統(tǒng)可能參與OMV的產(chǎn)生。這種ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)參與了將外膜磷脂轉(zhuǎn)運至內(nèi)膜，防止磷脂在外膜的外部小葉中積聚。而VacJ/Yrb ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的破壞，使得磷脂在外部小葉中積聚，從而改變了外膜曲率，增加了的OMV產(chǎn)生。

1.2革蘭陽性菌 革蘭陽性菌是一類由質(zhì)膜和厚的肽聚糖層包裹的細菌，由于其缺乏外膜且細胞壁較厚，起初人們認為它們不能產(chǎn)生和分泌細胞外囊泡。直至2009年Lee等[27]首次分離出金黃色葡萄球菌細胞外囊泡，并對革蘭陽性菌細胞外囊泡的成分進行廣泛的蛋白組學研究，證實了革蘭陽性菌同樣具有分泌細胞外囊泡的功能。迄今為止，人們已在金黃色葡萄球菌[27]、芽孢桿菌[28]、產(chǎn)氣莢膜梭菌[29]、李斯特菌[30]和肺炎鏈球菌[31]等革蘭陽性菌中發(fā)現(xiàn)了細胞外囊泡的存在。

對于細菌胞外囊泡如何突破厚的細胞壁，一直是人們討論的熱點。在對金黃色葡萄球菌細胞外囊泡成分的分析中，學者發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡攜帶肽聚糖降解酶，其可以降解厚的革蘭陽性菌肽聚糖細胞壁[27]。另一項關(guān)于枯草芽孢桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，原噬菌體表達的內(nèi)溶素導致肽聚糖層的破壞，從而引起細胞外囊泡的形成[32]。對于近年發(fā)現(xiàn)的細胞外囊泡特殊類型——管狀膜狀結(jié)構(gòu)(又稱之為納米管、納米線)，有學者提出可能是革蘭陽性細胞壁的局部裂解導致細胞質(zhì)膜膨脹，而細胞質(zhì)膜又引發(fā)納米管形成[33]。雖然目前缺乏革蘭陽性菌如何突破厚層細胞壁的確切證據(jù)，但可從一些對細胞外囊泡成分、形態(tài)等的研究中探索一些可能的機制。

1.3柔膜體綱類細菌 柔膜體綱類細菌是起源于革蘭陽性菌門的一種特殊細菌，經(jīng)過進化它們成為一類無細胞壁的微小原核生物，系統(tǒng)發(fā)育上接近梭菌屬[34]。Chernov等[35]于2011年首次在萊氏無膽甾支原體PG8中證實了柔膜體綱類細菌細胞外囊泡的分泌，并在電鏡下發(fā)現(xiàn)了其類似革蘭陰性菌出芽式的發(fā)生機制。而Gaurivaud等[10]更是在3種科屬的柔膜體綱類的5種細菌中證實了細胞外囊泡的分泌，分泌的細胞外囊泡大小變化很大，直徑為30～220 nm，且通過蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，其富含毒力蛋白。故推斷，細胞外囊泡的存在可能在柔膜體綱類細菌感染后，機體發(fā)病的過程中起關(guān)鍵作用。

2 細胞外囊泡的作用

作為細菌來源的不溶性及可溶性物質(zhì)的混合物載體，細胞外囊泡在細菌與細菌及細菌與宿主之間的通訊和相互作用中發(fā)揮重要作用，其使得細菌能在不利條件下更好的生存，并刺激宿主的免疫炎癥反應(yīng)。同時細胞外囊泡天然的免疫原性，或經(jīng)過人工設(shè)計提高的免疫原性，已被運用于一些感染性疾病的疫苗研制。

2.1分泌傳遞物質(zhì) 當細菌處于不利條件(營養(yǎng)缺乏)時，細胞外囊泡的分泌水平升高；而對細胞外囊泡進行分析發(fā)現(xiàn)，其包含一些降解酶和受體，可以幫助細菌獲取營養(yǎng)，促使細菌存活[36]。如銅綠假單胞菌分泌的含有PQS的細胞外囊泡，PQS在細胞間通訊和群體感應(yīng)中發(fā)揮重要作用[37]；同時PQS有與鐵載體相似的作用，鐵對于細菌生存十分重要，含有PQS的細胞外囊泡可以在鐵缺乏的情況下，幫助細菌分泌至遠處與鐵結(jié)合，并通過細胞外囊泡膜融合、內(nèi)化等方式，將鐵提供給細胞[38]。此外研究發(fā)現(xiàn)，在廣泛運用抗生素的過程中，細菌通過進化突變，產(chǎn)生了一定的抗生素抗性[39]，且可能通過細胞外囊泡分泌的方式將具有抗生素抗性的相關(guān)蛋白或基因進行細菌間的轉(zhuǎn)移。如將抗生素抗性蛋白(β-內(nèi)酰胺酶)轉(zhuǎn)移到鄰近細胞[40-41]或通過OMV與受體細胞膜融合后，將抗性基因轉(zhuǎn)移至受體細胞[42]。雖然細胞外囊泡的分泌對于細菌自身是一個耗能的過程，但這種分泌方式有著不可取代的優(yōu)點：①細胞外囊泡的包裹結(jié)構(gòu)，避免了生物微環(huán)境中細胞外蛋白酶對蛋白的降解；②細胞外囊泡內(nèi)物質(zhì)富集、體積小的特點，使得它們可以遠離親本細胞高濃度地將某些物質(zhì)傳遞給靶細胞。

2.2維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài) 細胞外囊泡的分泌，是細菌面對不利條件維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式之一。在使用外部刺激物(乙醇和多黏菌素)和內(nèi)部刺激物(過量表達毒性周質(zhì)蛋白)處理大腸埃希菌時，大腸埃希菌的超囊泡突變菌株能更好地在包膜應(yīng)激條件下存活，且囊泡中錯誤折疊蛋白的水平較管家蛋白明顯升高[43]。此外，細胞外囊泡還可作為誘餌來保護細菌免受補體成分[7]、長鏈醇、金屬螯合劑[44]和抗菌肽[8]的影響，可見細菌可通過分泌細胞外囊泡的形式清除有害物質(zhì)。

2.3協(xié)同構(gòu)成生物膜 生物膜的形成是細菌生存的重要策略，它可以提高細菌對抗生素的耐受性，避免不良物質(zhì)的滲入，抵御高溫、干燥等[45]。細菌在生物膜中以多細胞群體的形式存在，作為生物膜細胞外基質(zhì)的一部分，細胞外囊泡發(fā)揮重要作用[46]。細胞外囊泡存在的多價黏附素，使得細菌之間能夠黏附與共聚集。牙齦卟啉單胞菌分泌的含有黏附素的細胞外囊泡，有助于牙菌斑生物膜的發(fā)育[47]。除黏附作用外，細胞外囊泡還可以介導生物膜內(nèi)外的相互作用，可通過群體信號轉(zhuǎn)導分子介導細胞間通訊[37]，并向生物膜中的細菌進行營養(yǎng)輸送，結(jié)合或滅活抗生素、補體、抗體等有害物質(zhì)[7,48]。同時，細胞外囊泡的存在可以作為生物膜的攻擊性工具，裂解競爭細菌[36]。

2.4與宿主相互作用 人體細菌主要由厭氧菌組成，在健康的個體中，它們以與宿主共生的形式存在。這些厭氧菌具有重要的生理作用，如抑制病原微生物的生長、調(diào)節(jié)上皮屏障的分化、幫助營養(yǎng)物質(zhì)的代謝以及先天免疫功能的刺激等。雖然有上皮組織作為第一道屏障，但共生細菌產(chǎn)生的細胞外囊泡可“穿過”這種上皮屏障并與一些結(jié)締組織細胞(主要為免疫細胞)相互作用。人類微生物群中的一個成員脆弱擬桿菌顯示分泌含有莢膜多糖的OMV，其可以觸發(fā)樹突狀細胞中Toll樣受體2介導的信號轉(zhuǎn)導，誘導白細胞介素-10的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T細胞的分化，提示細胞外囊泡是建立共生的重要媒介[49]。

此外，致病菌分泌的細胞外囊泡在致病過程也有重要作用：①保護細菌免受宿主免疫反應(yīng)的攻擊，在營養(yǎng)稀缺的情況下獲取營養(yǎng)。②細胞外囊泡還攜帶著重要的細菌毒力因子，如產(chǎn)毒性大腸埃希菌胞外囊泡中的腸毒素及放線桿菌胞外囊泡中的白細胞毒素等，細胞外囊泡可以將這些毒素高效地運輸至遠離親本細胞的遠處，通過不同的機制將毒素傳遞到宿主細胞內(nèi)，造成更多、更大的損害[50-51]。然而，細胞外囊泡與宿主之間的作用復雜多樣，需更多的研究進一步探討。

2.5疫苗的研制 細胞外囊泡含有一些天然免疫刺激配體，如脂多糖、肽聚糖和細菌DNA等，稱之為微生物相關(guān)分子模式，它們可以被病原識別受體識別結(jié)合，從而引起促炎因子、趨化因子的產(chǎn)生和免疫細胞的募集[52]。一項有關(guān)腦膜炎奈瑟球菌細胞外囊泡的體內(nèi)研究，在小鼠體內(nèi)檢測到了長達120 d的記憶B和T細胞，且分泌的多種抗體具有殺菌活性，可見細胞外囊泡可誘導持久的體液免疫[53]。同時，霍亂弧菌細胞外囊泡也被證實可在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生持久的血清IgG、IgA、IgM及分泌型IgA，且還可在脾中引發(fā)更高百分比的CD4+T細胞分布[54]。有證據(jù)表明，具有較厚細胞壁的革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌[55]、肺炎鏈球菌[31])中分離的細胞外囊泡可以引發(fā)免疫反應(yīng)，在某些情況下提供疾病的保護。細胞外囊泡的免疫原性使其用于疫苗的研制成為可能，且因為它有類似細胞膜的結(jié)構(gòu)，所以相較于純化的抗原，細胞外囊泡更能以天然構(gòu)象顯示抗原，在產(chǎn)生中和抗體方面也更為有效。此外，細胞外囊泡的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、對內(nèi)容物的保護以及可相對低成本大量獲取等特性，也使其在疫苗的研制中具有一定優(yōu)勢。目前包含OMV的多元B群腦膜炎球菌疫苗已在26個醫(yī)學中心進行了Ⅲb期臨床試驗，用于預防侵襲性腦膜炎球菌病，且安全性及有效性得到廣泛認可[56]。

3小 結(jié)

根據(jù)目前的研究結(jié)果，原核生物普遍具有分泌細胞外囊泡的功能，但對于其產(chǎn)生的具體機制尚不完全明確。其中，周質(zhì)空間中肽聚糖片段或錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累在外膜上施加壓力；肽聚糖層之間交聯(lián)的減少；膜曲率誘導分子的富集是目前普遍認可的3種機制，但這些機制的提出可能局限于特定菌種或特定條件，不具有完全的普遍性。近年有研究提出，高度保守的VacJ/Yrb ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的破壞可能是參與OMV生成的一般機制[22]。細胞外囊泡具有重要的生物功能及利用價值，運用細胞外囊泡研制的疫苗已被許可用于腦膜炎奈瑟球菌病的預防[57]，更多革蘭陰性菌OMV制劑也在研究中。可見，細胞外囊泡在治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，但同時在細胞外囊泡的生產(chǎn)過程中也存在批次的一致性和純度、組織特異性等問題。因此，未來深入研究細胞外囊泡的產(chǎn)生機制及其相關(guān)特性，可為疾病的治療及預防提供新思路。