馬玉旋，馬 祎，江 雯，高孟秋，顧月清

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198)

自 1982 年美國科學(xué)家 Seeman 首次提出 DNA 納米技術(shù)的概念以來[1]，DNA納米技術(shù)已取得了突飛猛進的進展。其經(jīng)歷了從一維平面結(jié)構(gòu)、到二維立體結(jié)構(gòu)再到三維空間結(jié)構(gòu)的發(fā)展，且發(fā)展出了DNA折紙術(shù)[2]。到目前為止，以DNA為模板通過堿基特異性互補配對形成納米結(jié)構(gòu)的研究已有數(shù)千篇報道。并且隨著研究的深入，針對DNA納米技術(shù)的研究目標已經(jīng)從結(jié)構(gòu)控制逐漸向功能及應(yīng)用方面發(fā)展[3]。特別是近幾年來，DNA 納米結(jié)構(gòu)的自組裝技術(shù)日益成熟，其高度的結(jié)構(gòu)可控性、生物安全性及功能多樣性使得 DNA 納米結(jié)構(gòu)成為一種理想的藥物遞送載體[4]。本文總結(jié)了DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物遞送方面的優(yōu)勢及應(yīng)用。

1 DNA納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢

核酸因帶負電荷而難以透過表面帶相同負電荷的細胞膜。因此，通常需要轉(zhuǎn)染試劑(如脂質(zhì)體、Lip2000等)使細胞有效攝取核酸。但研究發(fā)現(xiàn)，與非結(jié)構(gòu)核酸不同，DNA納米結(jié)構(gòu)很容易通過膜屏障，因此 DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物遞送方面，具有以下優(yōu)點。

首先，DNA納米結(jié)構(gòu)可預(yù)測且尺寸和形狀可控。通過可編程DNA雜交，可以方便地將DNA納米結(jié)構(gòu)制備成預(yù)先設(shè)計的尺寸和形狀，產(chǎn)率較高。不同的DNA納米結(jié)構(gòu)的流體力學(xué)尺寸通常在10～200 nm左右，這使得它們能夠利用腫瘤區(qū)域的EPR效應(yīng)。此外，具有合適的尺寸和親水性表面的DNA納米結(jié)構(gòu)，可部分減少巨噬細胞在循環(huán)過程中的光化反應(yīng)和隨后的清除[5]。

其次，DNA納米結(jié)構(gòu)具有可編程性和可尋址性。除了結(jié)構(gòu)可編程性外，DNA納米結(jié)構(gòu)還可以方便地修飾多個功能單元[6-11]。這些功能單元(包括靶向適體、抗癌藥物分子、基因序列、蛋白質(zhì)有效載荷、成像對比探針等) 可通過共價鍵、核酸堿基對、生物素-親和素相互作用、插入、適配體-靶點相互作用、DNA-蛋白質(zhì)相互作用和包封的方式與DNA納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，并顯示出高的負載能力和精準的位置，這使得DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物裝載和靶向上成為一種較有吸引力的材料。

此外，DNA納米結(jié)構(gòu)具有被細胞內(nèi)化的能力。盡管已知核算難以穿透細胞膜，但具有特點幾何結(jié)構(gòu)的DNA納米結(jié)構(gòu)卻可以。Mao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葉酸標記的DNA納米管能靶向癌細胞表面的葉酸受體，隨之內(nèi)化進入腫瘤細胞中。2011年，Turberfield等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在沒有配體或轉(zhuǎn)染劑的存在下，DNA四面體能順利進入共培養(yǎng)的活細胞中，說明具有特定結(jié)構(gòu)的DNA納米結(jié)構(gòu)能被哺乳動物細胞內(nèi)化，而不受DNA表面的電荷影響。

還有，DNA納米結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定存在于正常生理條件下。Yan Meldrum等[14]研究發(fā)現(xiàn)DNA折紙結(jié)構(gòu)在細胞裂解液長達12小時孵育下，仍能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，依舊以折紙結(jié)構(gòu)存在。相反，常規(guī)的單鏈或雙鏈同條件下孵育后完全檢測不到完整的DNA鏈。Conway等[15]研究發(fā)現(xiàn)，具有特點結(jié)構(gòu)的三角形棱狀DNA納米結(jié)構(gòu)在血清中比單鏈更穩(wěn)定，經(jīng)凝膠分析得出，在10%胎牛血清中，單鏈和完整結(jié)構(gòu)的DNA 半衰期分別是1小時和2小時，而經(jīng)化學(xué)修飾后的DNA納米結(jié)構(gòu)半衰期大于24小時。

最后，DNA 納米結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性。DNA分子作為一種存在于所有生物中的天然物質(zhì)，具有固有的生物相容性。一些報道的DNA納米結(jié)構(gòu)已被證明在細胞和動物水平上是安全和免疫惰性的[16]。并且，DNA納米結(jié)構(gòu)最終將在細胞和生物體內(nèi)被降解和清除[17]。

2 小分子藥物的遞送研究

具有蒽環(huán)類結(jié)構(gòu)的化療藥物如阿霉素等可以插入DNA結(jié)構(gòu)，并通過緩解扭轉(zhuǎn)應(yīng)力與DNA緊密結(jié)合在一起。利用此特征，現(xiàn)已構(gòu)建了多種較好的載藥DNA納米結(jié)構(gòu)，并對其體外和體內(nèi)治療效果進行了研究。如Huang等[17]利用DNA二十面體納米結(jié)構(gòu)負載阿霉素，并修飾MCF-7細胞的靶向的適配體進行癌癥治療。研究發(fā)現(xiàn)與人乳腺癌細胞株(MCF-7)孵育后，靶向DNA二十面體與單獨的藥物治療或不具有靶向功能的DNA二十面體相比，細胞內(nèi)化程度提高，細胞毒性降低。Ding等[19]利用三角形和管狀DNA折紙納米結(jié)構(gòu)作為阿霉素遞藥的載體，制備了負載阿霉素的DNA折紙結(jié)構(gòu)，并將其應(yīng)用于正?；虬⒚顾啬退幍娜巳橄侔┘毎?MCF-7)。研究發(fā)現(xiàn)，DNA折紙納米載體增強了藥物在病變細胞中的積累，不僅對正常MCF-7細胞具有顯著的細胞毒性，而且對阿霉素耐藥的MCF-7細胞也具有顯著的細胞毒性。

放射性同位素锝-99m可以共價連接到單鏈DNA上，然后組裝到DNA納米結(jié)構(gòu)中發(fā)揮其功能。Fan[20]等設(shè)計了多臂DNA四面體納米結(jié)構(gòu)(TDNs)作為體內(nèi)造影劑，可實現(xiàn)近紅外(NIR)熒光和單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)的雙模態(tài)成像。他們將NIR染料Dylight-755與其中一條核心鏈共軛，并自組裝成TDNs結(jié)構(gòu)。然后在TDNs的多臂ssDNA結(jié)構(gòu)上修飾靶向配體葉酸和放射性同位素99mTc。雙標記TDNs探針實現(xiàn)了在細胞水平和動物水平NIR和SPECT雙模式成像的能力。采用NIR熒光成像技術(shù)，評價了TDNs在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)，與單鏈DNA相比，其體內(nèi)生物分布和循環(huán)時間明顯不同。

3 功能核酸類藥物的遞送研究

具有獨特生物醫(yī)學(xué)功能的核酸能夠通過堿基互補配對的方式與DNA納米載體結(jié)合。幾種功能核酸，如CpG序列、反義序列、siRNA、miRNA等，均已被設(shè)計成DNA納米結(jié)構(gòu)[21]。如Fan等[22]設(shè)計了一種含有CpG序列的DNA四面體，用簡單的退火程序就可將四條DNA鏈(含四面體組裝的核心序列和CPG序列)組裝成DNA四面體結(jié)構(gòu)。與游離CpG序列相比，負載了CpG序列的四面體具有較好的穩(wěn)定性，無需轉(zhuǎn)染試劑即可有效地被巨噬細胞RAW264.7細胞攝取。在TLR9識別后，含CpG的四面體可使腫TNF-α、IL-6和IL-12等促炎細胞因子的表達升高，顯示了納米結(jié)構(gòu)的有效免疫刺激作用。Rehberg[23]等研究了裝載了CpG序列的DNA納米管在體內(nèi)對免疫細胞的影響。采用單鏈Tiles(SST)方法設(shè)計了8螺旋DNA納米管，并通過CpG基序?qū)γ總€管中的24個Tiles進行了擴展。與其他DNA納米載體相似，負載了CpG的DNA納米管在巨噬細胞中表現(xiàn)出TNF-α反應(yīng)。將DNA納米管注射到麻醉小鼠的骨骼肌中，用體內(nèi)顯微鏡觀察到DNA納米管被組織駐留的巨噬細胞內(nèi)化。與未載藥的DNA納米管或游離的CpG不同，裝載了 CpG的DNA納米管招募大量白細胞進入肌肉組織，并激活周圍細胞中的NF-κB通路，表明DNA納米管是靶向組織巨噬細胞的有效運載工具。 Anderson[24]等設(shè)計了裝載siRNA的多功能DNA四面體結(jié)構(gòu)，可用于體內(nèi)靶向治療。DNA四面體納米粒子可以將siRNA傳遞到腫瘤細胞中，并下調(diào)靶基因。在小鼠腫瘤模型中，葉酸修飾的DNA四面體納米粒子比單獨的siRNA(t1/2≈6min)具有更長的血液循環(huán)時間，和穩(wěn)定的基因沉默效果。

4 蛋白多肽類藥物的遞送研究

DNA納米結(jié)構(gòu)可通過特異性反應(yīng)與蛋白質(zhì)或多肽相結(jié)合，已廣泛用于相關(guān)藥物遞送。Yan[25]等人在DNA四面體納米結(jié)構(gòu)中同時組裝了抗原(鏈霉親和素分子)和免疫佐劑(GpG)。與抗原和CpG分子的混合物相比，共組裝的DNA四面體(抗原佐劑復(fù)合物)在體內(nèi)觸發(fā)了強烈、特異和持久的免疫反應(yīng)，而不會對DNA支架本身產(chǎn)生不良反應(yīng)。Chen[26]等最近報道了滾環(huán)擴增(RCA)驅(qū)動的DNA-RNA納米膠囊，將CpG、Stat3短發(fā)夾RNA佐劑和腫瘤特異性肽作為納米疫苗用于協(xié)同癌癥免疫治療。RCA過程將CpG和shRNA結(jié)合在一起，然后自組裝成DNA-RNA納米膠囊。經(jīng)PPT-g-PEG修飾后，DNA-RNA納米粒子通過疏水相互作用進一步負載腫瘤特異性肽作為協(xié)同納米疫苗，DNA-RNA納米膠囊在淋巴結(jié)(LNs)中被遞送給抗原提呈細胞(APC)，引起有效和持久的抗原特異性T細胞反應(yīng)，并抑制腫瘤的進展。

5 智能響應(yīng)型DNA納米遞藥系統(tǒng)

具有刺激響應(yīng)特性的天然大分子在生物系統(tǒng)中發(fā)揮各種重要作用。這些自組裝生物分子在動態(tài)條件下工作，可對微妙的生物變化做出反應(yīng)，以實現(xiàn)其功能。在自然生物大分子系統(tǒng)的啟發(fā)下，分子尺度上的人工系統(tǒng)或機器的自下而上的設(shè)計、建造和操作是納米科學(xué)和技術(shù)中的熱門話題。其中，DNA分子已被證明可在感知、激活和響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵功能，DNA納米技術(shù)也從結(jié)構(gòu)研究擴展到功能方面的研究，智能響應(yīng)型DNA納米遞藥系統(tǒng)應(yīng)運而生，且已取得了豐碩的研究成果。響應(yīng)因子在響應(yīng)型遞藥系統(tǒng)中起重要作用，目前智能響應(yīng)型DNA納米遞藥系統(tǒng)主要可分為pH、光、溫度、特異性酶和mRNA響應(yīng)這幾類[27]。如Kim等[28]人將富含胞嘧啶的i-motif結(jié)構(gòu)域設(shè)計在四面體的一個邊上，設(shè)計了可pH響應(yīng)的DNA四面體結(jié)構(gòu)。在正常pH下DNA四面體裝載的蛋白可以免受蛋白酶的影響，但在腫瘤區(qū)域，富胞嘧啶的邊在酸性pH下通過形成i-motif結(jié)構(gòu)而被破壞，裝載的蛋白從四面體中暴露出來并被激活。我們課題組利用腫瘤細胞端粒酶特異性表達的特性，設(shè)計了端粒酶響應(yīng)型DNA二十面體結(jié)構(gòu)。我們將端粒酶的響應(yīng)序列和引物序列設(shè)計到DNA二十面體結(jié)構(gòu)的序列中，同時裝載鉑納米藥物。實驗發(fā)現(xiàn)，該DNA二十面體結(jié)構(gòu)只針對端粒酶特異性表達的腫瘤細胞釋藥，在正常細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。很好的實現(xiàn)了腫瘤細胞響應(yīng)性釋藥，避免了對正常細胞的毒性[29]。

6 展望

盡管DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物遞送方面已取得廣泛應(yīng)用，但目前還未有相關(guān)藥物上市。所以其發(fā)展趨勢應(yīng)該以實際應(yīng)用為出發(fā)點，首先應(yīng)該闡明DNA納米結(jié)構(gòu)的細胞內(nèi)吞機制、細胞內(nèi)命運、藥物動力學(xué)(即體內(nèi)循環(huán)、分布、代謝、排泄等)。及研究它們的細胞內(nèi)行為與這些結(jié)構(gòu)物理/化學(xué)性質(zhì)(例如幾何形狀、表面電荷、堿基組合)之間的關(guān)系。此外，DNA納米結(jié)構(gòu)的高純度制備和大規(guī)模生產(chǎn)也是影響其應(yīng)用的巨大挑戰(zhàn)，這是實際生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的必要條件。目前也有研究在解決這些問題。如Shih等開發(fā)了瓊脂糖凝膠分離，用于純化高產(chǎn)率的DNA折紙納米結(jié)構(gòu)。相信在研究人員的不斷努力下，DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物遞送方面定能取得更大的進步。