王曉玥，張麗紅，范 娜，童明瓊

(德州學(xué)院 醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023)

現(xiàn)階段人民生活節(jié)奏普遍較快，工作壓力大，人類健康正遭遇前所未有的挑戰(zhàn)，發(fā)病率的增高使得我們對藥物的需求量逐漸增大。中醫(yī)藥在我國應(yīng)用歷史十分悠久，中藥材物種豐富，具有多種藥理活性，包括抗菌、抗腫瘤、抗炎、對心臟血管系統(tǒng)起效等。中藥包括植物藥、動物以及礦物等，其中植物藥占比最大，如《中藥大辭典》中收錄的中藥種類近6000種，植物藥占80%以上，因此有“諸藥以草為本”的說法[1]。天然產(chǎn)物是指從生物體內(nèi)的多種內(nèi)源性的天然存在的化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物[2]，中藥材治療過程中發(fā)揮藥理作用的有效成分是天然產(chǎn)物來源的寶庫。中藥材中天然產(chǎn)物呈現(xiàn)生物活性多樣化及多靶點(diǎn)等特性，是現(xiàn)在新藥研究的一大熱點(diǎn)。然而多種天然產(chǎn)物現(xiàn)今仍主要提取自野生藥用植物，隨著發(fā)病率上升，藥物需求量增大，采挖量的增加導(dǎo)致藥用植物資源急劇減少，阻礙著中藥材及天然產(chǎn)物的應(yīng)用和發(fā)展。中藥材內(nèi)生真菌可能含有與中藥材同樣的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量高，并且具有良好的可再生性，因此從中藥材內(nèi)生真菌中尋找能夠產(chǎn)生活性天然產(chǎn)物的菌株具有重要價值。

1 中藥材天然產(chǎn)物的應(yīng)用及局限性

中藥材在多種疾病中具有良好的治療效果，如中醫(yī)藥在癌癥的治療上已經(jīng)起到了非同小可的作用?，F(xiàn)在研究表明，多種中藥材具有抗腫瘤治療、提高免疫力及治療耐受性、避免手術(shù)，延長生存時間的獨(dú)特優(yōu)勢，可以從多個方面控制疾病。如紫杉醇是抗癌天然產(chǎn)物中的明星藥物，其主要作用于微管，通過破壞癌細(xì)胞的有絲分裂過程，進(jìn)而起到阻止癌細(xì)胞無限增殖的作用，臨床上主要用于治療乳腺癌等多種癌癥[3]。再如傳統(tǒng)中藥材雷公藤，現(xiàn)在也會被用于腫瘤的治療，現(xiàn)代研究表明其中含有的雷公藤紅素可以抑制癌癥新生血管生成[4]，是一種十分具有研究前景的天然產(chǎn)物。除此之外，雷公藤紅素還有多種藥理功能，包括抑制動脈粥樣硬化斑塊形成[5]、抗艾滋病毒[6-7]、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]、改善肥胖哮喘氣道炎癥等。

由此可見，中藥材的天然產(chǎn)物可以用來治療多種疾病，很多天然產(chǎn)物處于供不應(yīng)求的狀態(tài)?，F(xiàn)階段天然產(chǎn)物的獲取方式具有極大的局限性，主要包括直接從植物中提取，人工合成，半合成及組織培養(yǎng)等。多種天然產(chǎn)物主要提取于中藥材，然而中藥材中有效化學(xué)成分含量往往較低，若僅依賴于從中藥材中提取天然產(chǎn)物，需要大量砍伐藥材資源，可能導(dǎo)致物種瀕臨滅絕，破壞物種多樣性。同時，為保證藥用成分含量的積累，多數(shù)藥材需要多年種植才能采收，進(jìn)一步限制了天然產(chǎn)物的應(yīng)用。許多天然產(chǎn)物可以通過人工合成獲得，但是天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致了工業(yè)合成的難度極大，所需經(jīng)費(fèi)高，人力物力浪費(fèi)嚴(yán)重。半合成方法相對而言研究較為透徹，但是操作過程中仍然需要使用大量中藥材，未能從根本解決藥用資源匱乏問題。組織培養(yǎng)法建立耗時久，所需成本高，同時難以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。由此可見，尋找有效天然產(chǎn)物的獲取方式十分重要。

2 中藥材內(nèi)生真菌分離意義

內(nèi)生真菌是真菌生物多樣性的重要組成部分之一。內(nèi)生真菌生存于植物的葉和莖之中并能完成生活的周期的真菌，在植物體內(nèi)普遍存在，但是它不容易被識別，對宿主植物不具有致病性，而是依賴共生的關(guān)系。宿主植物可以提供給內(nèi)生真菌的生存所需的營養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌通過促進(jìn)植物生長發(fā)育及進(jìn)化過程等方式回報宿主植物[9]。如鄒暉林等[10]將內(nèi)生真菌液澆灌到鐵皮石斛的盆栽中，進(jìn)行了為期6個月的干旱培養(yǎng)，并觀察記錄其外形變化、存活率等指標(biāo)。結(jié)果表明，接受了內(nèi)生真菌灌溉的鐵皮石斛苗比對照組長勢要好，說明植物內(nèi)生真菌可以幫助植物生長并增加其抗逆性。蘇珍珠等[11]實驗表明，將內(nèi)生真菌稻鐮狀瓶霉接種于水稻種子，幼苗的株高及葉寬會顯著增加，同時營養(yǎng)吸收相關(guān)基因活躍表達(dá)，說明植物內(nèi)生真菌對促進(jìn)植物的生長起到了積極的作用。

內(nèi)生真菌除具有可促進(jìn)宿主植物生長發(fā)育等作用外，還可以產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物。現(xiàn)階段，在內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)物包括抗病毒劑，抗氧化劑，還包括抑菌劑等。

3.1 產(chǎn)生與宿主植物相同的代謝產(chǎn)物

內(nèi)生真菌生長過程中會產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物，同時可以通過基因重組獲得的宿主植物的某些基因所產(chǎn)生與宿主植物相同的產(chǎn)物，因此內(nèi)生真菌總代謝物相比宿主植物而言可能更為多樣。程玉鵬等[12]總結(jié)了多種藥用植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物規(guī)律，發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)紫杉醇，長春花內(nèi)生真菌可產(chǎn)長春新堿，喜樹內(nèi)生真菌產(chǎn)物中含有喜樹堿，以上成分均與原植物次生產(chǎn)物相同，且已經(jīng)合成藥物。此外，多種藥用植物內(nèi)生真菌正在進(jìn)行研究。曹曉冬[13]等從滇重樓的根狀莖中分離得到3株可以合成大量的甾體化合物的內(nèi)生真菌?？聵錈樀萚14]從番木瓜植株的葉片、果實和莖中分離得到一株內(nèi)生真菌為青霉屬橘青霉，通過薄層層析等實驗方法測定其代謝產(chǎn)物含有黃酮類物質(zhì)。

3.2 產(chǎn)生新型結(jié)構(gòu)化合物

近年來，植物內(nèi)生真菌中分離得到了多種活性化合物，除與宿主植物相同的產(chǎn)物外，還發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物[15]，主要包括生物堿、甾體及萜類等[16]。如Lu等[17]從黃花籬的內(nèi)生真菌中得一種新的具有抗菌作用的吲哚類生物堿。徐振魯?shù)萚18]對荒漠植物霧冰藜的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離研究，得到4個松蘿酸結(jié)構(gòu)類似物，其中有一個新的化合物，并且具有抗腫瘤活性。張武德等[19]從丹參細(xì)胞中分離出8個新型的化學(xué)成分，這些物質(zhì)分別有抗癌，抗病毒，神經(jīng)保護(hù)的作用。由此可見，內(nèi)生真菌是新型天然產(chǎn)物挖掘與篩選的重要來源之一。

4 中藥內(nèi)生真菌藥用價值研究進(jìn)展

中藥材藥理活性多樣，當(dāng)中藥材基原植物作為宿主植物時，其內(nèi)生真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能具有同樣的藥理活性，對于疾病的治療具有臨床應(yīng)用的前景。

4.1 抗氧化作用

生物體在生長過程中，體內(nèi)不斷產(chǎn)生自由基，如若不及時清除，過量自由基積累會對人類健康造成危害?，F(xiàn)階段，有多種內(nèi)生真菌產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的自由基清除及抗氧化的功能。潘峰等[20]從川貝母鱗莖中分離得到一株內(nèi)生真菌，利用石油醚等四種有機(jī)溶劑提取的發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出良好的自由基清除活性。鄭帥等[21]從刺五加中分離純化得到的內(nèi)生真菌中提取代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵液菌株BXPL6和CBR1對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除活性。鄭朝輝等[22]從黃芩內(nèi)生真菌的乙酸乙酯培養(yǎng)物中提取到的鄰苯二甲酸二正丁酯等三種成分對自由基的清除能力也非常高。內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力與培養(yǎng)條件及時間相關(guān)，如崔晉龍等[23]在柴胡紅景天中研究一株命名為菌Rb-R-1的內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)在含有乳糖及牛肉膏的培養(yǎng)基中，中性pH值條件下，25 ℃培養(yǎng)10 d時，發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH的清除率達(dá)到最高值。

4.2 抗癌抗腫瘤作用

近年來癌癥發(fā)病率的上升極大地危害了人民健康，抗癌抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選迫在眉睫，內(nèi)生真菌為尋找抗癌天然藥物提供了新的思路，多種抗癌活性產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)。如陳淑娟等[24]從紅豆杉內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出一種化合物經(jīng)過檢測，對惡性黑色素瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，且與濃度呈正相關(guān)。楊明俊等[25]從水仙根莖中的內(nèi)生真菌分離真菌并對其進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯提取的內(nèi)生真菌發(fā)酵液可以抑制肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的生長，同時對金黃色葡萄球菌等細(xì)菌同樣具有抑制作用；鐵皮石斛內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取物具有類似藥理作用[26]。

宮頸癌嚴(yán)重危害了女性健康，繆莉等[27]使用乙酸乙酯萃取了銀杏內(nèi)生真菌的發(fā)酵液并鑒定得到，分離出四種化合物，發(fā)現(xiàn)其中一種化合物羥基曲霉酸，MTT實驗證明該成分可抑制HeLa細(xì)胞生長；陳吳海等[28]提取和純化了藏紅花內(nèi)生真菌CSL-27的多糖成分，同樣發(fā)現(xiàn)在多糖濃度為0.5 mg/mL時對HeLa細(xì)胞的增殖有抑制性。代金霞等[29]對寧夏枸杞的內(nèi)生菌資源進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)4株內(nèi)生真菌對腫瘤的抑制率高于50%。研究表明，雌激素受體的轉(zhuǎn)錄途徑與包括乳腺癌在內(nèi)的多種疾病相關(guān)，異常表達(dá)會影響代謝通路導(dǎo)致疾病的發(fā)生，疾病水平積累會導(dǎo)致雌激素受體的消亡，因此臨床上常使用雌激素受體激活劑進(jìn)行治療。廖祖健等[30]研究了金線蓮的內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)三種產(chǎn)物可特異性轉(zhuǎn)錄激活雌激素受體，后續(xù)試驗證明其可抑制某些癌細(xì)胞增殖，對其深入研究有成藥潛能。民族藥是我國中藥的重要組成部分之一，是少數(shù)民族人民智慧的結(jié)晶，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮了重要的功能。黃益[31]分離了藏藥大花綠絨蒿的4種內(nèi)生真菌，通過體內(nèi)和體外實驗證明其均具有一定的抗腫瘤活性，且活性與結(jié)構(gòu)之間存在相關(guān)性。

4.3 抗菌抑菌作用

微生物的多樣性對地球生態(tài)環(huán)境的維持至關(guān)重要，然而某些病原微生物的生存會危害到其他生物的健康。研究表明，某些內(nèi)生真菌的活性產(chǎn)物對病原微生物會起到抑制作用。王營等[32]對從廣藿香多部位分離得到的內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌試驗檢測，發(fā)現(xiàn)至少20種內(nèi)生真菌具有抗病原菌活性。抑菌試驗中常使用大腸桿菌作為供試菌，作為產(chǎn)物的抑菌效果的指標(biāo)。張慧茹等[33]將絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液加入生長中的大腸桿菌培養(yǎng)液中，觀察到大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生了嚴(yán)重的破損，蛋白質(zhì)合成異常，說明絞股藍(lán)內(nèi)生真菌對大腸桿菌有抑制性；王利梅等[34]從金葉女貞中分離內(nèi)生真菌，以大腸桿菌等為試驗指示菌株，經(jīng)測定一半以上的內(nèi)生真菌有抑菌性。也有研究使用其它常見病原菌作為指標(biāo)，劉雷等[35]對川麥冬進(jìn)行分離得到內(nèi)生真菌，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)分離的菌株對白色念珠菌具較強(qiáng)的有抑制活性。張維瑞等[36]研究發(fā)現(xiàn)杜仲中分離得到的內(nèi)生真菌可產(chǎn)生綠原酸，且發(fā)現(xiàn)1株內(nèi)生真菌對芽孢桿菌抑制率高達(dá)到80%。劉艷明等[37]篩選具有抗炭疽病活性的鐵皮石斛內(nèi)生真菌的菌株，發(fā)現(xiàn)其中三株真菌的平均抑菌率高達(dá)85%以上。除此之外，對植物病原菌的抑制性也有報道，卿朕等[38]分離了廣西地不容的內(nèi)生真菌，用有機(jī)溶劑提取發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物使煙草黑脛病菌可溶性蛋白含量降低，說明對其有抑制性。何應(yīng)紅等[39]提取青蒿中的內(nèi)生真菌，以五種常見的獼猴桃病原作為指示菌，研究發(fā)現(xiàn)，50%以上的內(nèi)生真菌對其都有抑制性。

4.4 其他藥理作用

藥用植物內(nèi)生真菌還可以產(chǎn)生增強(qiáng)免疫力、治療糖尿病等治療作用的活性物質(zhì)。焦志強(qiáng)等[40]以植物絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液中提取的胞外多糖為研究對象，通過體外實驗研究對肉雞的影響，發(fā)現(xiàn)在飼料中添加胞外多糖，可以使肉雞消化能力加強(qiáng)，提高細(xì)胞免疫和體液免疫的能力，從而增加經(jīng)濟(jì)效益。徐祥林等[41]對羅漢果內(nèi)生真菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶有較好的抑制活性，說明它可以制成抗糖尿病藥物。

5 總結(jié)與展望

自古至今，中藥材在疾病治療方面一直發(fā)揮著其不可替代的作用。中藥材的療效歸功于其中含有的天然產(chǎn)物。現(xiàn)階段，許多天然產(chǎn)物已在臨床使用，如紫杉醇、鬼臼毒素、喜樹堿等。然而多種天然產(chǎn)物由于獲取途徑的局限性，產(chǎn)量仍然較低，極大阻礙了中藥材及天然產(chǎn)物的應(yīng)用和發(fā)展。中藥材內(nèi)生真菌因其可能含有與中藥材同樣的代謝產(chǎn)物、產(chǎn)量高、可再生性強(qiáng)等特性，在活性天然產(chǎn)物的開發(fā)和獲取方面具有重要價值。一方面可以解決現(xiàn)階段中藥材資源匱乏問題，另一方面可以提高藥物產(chǎn)量，降低成本及藥物售價，造?；颊?。然而，現(xiàn)階段僅有極小部分內(nèi)生真菌資源被開發(fā)，許多資源尚處于研究空白狀態(tài)。同時，僅有不到5%的真菌可在現(xiàn)今通用的培養(yǎng)基上生長，極多菌種無法分離得到，人類對微生物世界知之甚少。隨著分子手段的革新，可將高通量測序技術(shù)與內(nèi)生真菌的分離相結(jié)合，更好的分析微生物群落結(jié)構(gòu)；并加強(qiáng)微生物培養(yǎng)手段的革新，發(fā)掘更多內(nèi)生真菌，為進(jìn)一步豐富人類對中藥材內(nèi)生真菌的認(rèn)識打下堅實基礎(chǔ)，為疾病的治療提供更多途徑。