王月 王雪 底煜

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是一種視網(wǎng)膜血管增生性病變，在早產(chǎn)兒與低體質(zhì)量兒中多有發(fā)生，是目前我國兒童致盲的主要原因。對于ROP的發(fā)病機制雖有待于進一步研究確認(rèn)，但是目前尚有研究認(rèn)為視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)生成的主要因素為相對缺氧，并且針對相對缺氧機制開展了大量的研究[1]?？寡軆?nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體在視網(wǎng)膜新生血管相關(guān)疾病中的應(yīng)用使ROP的治療出現(xiàn)了革命性的改變，其可有效保護患兒的視力[2]。但是，目前抗VEGF藥物治療ROP仍屬于超適應(yīng)證用藥，反復(fù)應(yīng)用有增加患心血管疾病的風(fēng)險[3]。抗VEGF藥物對患兒發(fā)育的影響以及安全性問題引起了廣泛關(guān)注，其安全性以及安全劑量仍需進一步探索。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)為長度大于200個核苷酸，并且基本不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本。近十余年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在生命體不同的生物進程中均發(fā)揮著不同功能，包括疾病的發(fā)生、細(xì)胞周期、干細(xì)胞分化等,以RNA的形式實現(xiàn)基因水平調(diào)控。lncRNA主要在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后修飾等不同層面發(fā)揮著重要功能[4]。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA影響早產(chǎn)兒眼部的發(fā)育，在ROP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。通過對不同成熟時期的視網(wǎng)膜全基因組表達譜及逆行分析，發(fā)現(xiàn)部分保守lncRNA在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中表現(xiàn)出動態(tài)表達趨勢[6]。眼具有良好的藥物代謝功能，基于目前l(fā)ncRNA在ROP中的研究，基因治療有望使機體長期穩(wěn)定安全地生成內(nèi)源性抑制血管生成的細(xì)胞因子，從而有效治療視網(wǎng)膜新生血管疾病，避免反復(fù)應(yīng)用抗VEGF藥物，降低對早產(chǎn)兒生長發(fā)育的影響[7]。

1 lncRNA在ROP的表達與功能

Chen等[5]通過對眼組織不同部分的lncRNA表達進行研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在角膜、晶狀體以及視網(wǎng)膜中呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，并且提供了在不同時期不同組織中的表達譜，認(rèn)為lncRNA具有控制基因表達的作用，調(diào)控組織的復(fù)雜性。Smith等[8]在針對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy,OIR)小鼠模型的研究表明，小鼠RNV有血管閉塞期以及新生血管形成期。蔣沁等[9]通過微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)，在2個新生血管發(fā)生與發(fā)展的不同時期,分別有326種和51種lncRNA的差異表達。應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，在這2個階段,有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路是最重要的信號富集途徑，參與多種病理生理反應(yīng)，促進新生血管的生成。

彭芬等[10]采用高通量測序技術(shù)研究OIR模型視網(wǎng)膜lncRNA 表達譜，結(jié)果提示1118條lncRNA與其相關(guān)，其中950條表達上調(diào)，168條表達下調(diào)。進一步針對其中6條lncRNA進行研究發(fā)現(xiàn)，存在潛在靶基因調(diào)控新生血管的形成，具有代表性的有堿性成纖維細(xì)胞生長因2 (fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、受體酪氨酸激酶樣孤兒素受體β等。張勁松等[11]利用Arraystar Human LncRNA array (Version 2．0)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、人脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞以及人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞提取的RNA分別進行測序，篩選出在內(nèi)皮細(xì)胞中表達比非內(nèi)皮細(xì)胞高2倍的lncRNA，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞富含的lncRNA與胚胎發(fā)育以及血管的發(fā)育相關(guān)度更高。漆晨等[12]通過建立OIR小鼠模型，針對蛋白表達譜進行分析發(fā)現(xiàn)，在OIR模型和正常組小鼠的眼組織中，細(xì)胞因子血小板因子4(platelet factor 4,PF-4)、P選擇素(recombinant P-selectin，SELP)、血管內(nèi)皮生長因子A、CXC趨化因子配體16(CXCL16)、可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNF-R) II和血管細(xì)胞黏附因子(VCAM)-1呈現(xiàn)顯著差異性表達。

2 lncRNA參與ROP的相關(guān)研究

lncRNA在RNV形成的細(xì)胞增殖、細(xì)胞運動以及視網(wǎng)膜血管在視網(wǎng)膜的發(fā)育以及視功能的維持中均具有十分重要的作用。但是視網(wǎng)膜無功能血管的生長和消退會伴隨缺血性疾病的發(fā)生，ROP主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜新生血管的形成,最近一項研究結(jié)果表明,生理血管生成和病理新生血管可能遵循不同的路徑[13]。lncRNA凋亡的過程中均有參與，在炎癥免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14-15]。另外，lncRNA通過調(diào)控VEGF的表達而促進RNV的形成也是ROP的重點研究領(lǐng)域[16]。

2.1 lncRNA參與VEGF表達的調(diào)控lncRNA參與VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控已經(jīng)得到證實，在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞上，lncRNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(myocardial infarction-associated transcript ,MIAT)可以作為一個競爭性內(nèi)源RNA吸附miR-150-5p干預(yù)miR-150-5p與VEGF mRNA的結(jié)合，最終實現(xiàn)VEGF水平的調(diào)節(jié)[9，17]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白1具有多種功能，在新生血管的形成、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞存活、遷移及侵襲等功能中均有參與，平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞富集的遷移/分化相關(guān)的非編碼長鏈RNA (smooth muscle and endothelial cell-enriched migration/differentiation-associated long noncoding RNA,SENCR) 在脈絡(luò)膜新生血管表達的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白1是VEGF和信號素蛋白3A腦信號蛋白所共有的膜結(jié)合受體[11]。在RNV患者的房水中檢測到lncRNA-Vax2osl和lncRNA-Vax2os2表達上調(diào)，與VEGF上調(diào)趨勢相符合，提示上述2種lncRNA在RNV的形成中發(fā)揮的作用與VEGF相似。

通過KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫分析，推測PI3K-VEGF信號通路與ROP相關(guān)[18]，與CYR61-PI3K/AKT信號促進OIR小鼠RNV形成的結(jié)論相符[19]。沉默高半胱氨酸能夠有效抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinase / serine threonine kinase，PI3K)信號通路，減少RNV的生成。PI3K抑制LY294002通過阻斷P13K/AKT信號通路，能夠下調(diào)視網(wǎng)膜VEGF的表達,抑制RNV的形成[20]。在心肌缺血-再灌注過程中，F(xiàn)GF2可通過激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和PI3K信號通路，抑制FGF2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和線粒體損傷[20]。研究顯示，F(xiàn)GF2與PI3K 通路相關(guān)[6]。

2.2 lncRNA參與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖、遷移與凋亡牛磺酸上調(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)是一種剪接的多聚腺苷化RNA，在發(fā)育中的視網(wǎng)膜和大腦以及成人組織中都有表達,參與視網(wǎng)膜發(fā)育及光感受器形成[21]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)具有清除體內(nèi)過剩氧自由基的作用，有助于判斷生物體抗氧化損傷。研究表明,SOD1能夠?qū)?nèi)皮釋放一氧化氮的功能進行抑制而達到保護內(nèi)皮細(xì)胞的作用，若細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD1，內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能會受到影響，促進凋亡。敲低lncRNA-TUG1表達能使SOD水平升高，降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率[22]。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的主要通路，細(xì)胞的凋亡與增殖均與其激活物相關(guān)，在細(xì)胞實驗中，MIAT下調(diào)可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性[23]。在研究MIAT表達沉默對體外內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，在高氧脅迫時以及低氧脅迫時，MIAT的表達沉默均能顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞活力，加速細(xì)胞凋亡，明顯減少線粒體去極化，明顯增加死亡細(xì)胞數(shù)量[24]。敲除人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1) 使磷酸化水平P38明顯降低，沉默P39/MAPK通路，應(yīng)用P38/MAPK通路抑制劑能夠阻斷MALAT1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖過程。

midkine(MDK)又稱神經(jīng)軸突生長因子2，是低分子量肝素結(jié)合生長因子的一種，主要參與妊娠中期視黃酸應(yīng)答反應(yīng)基因的發(fā)育，MDK對于細(xì)胞增殖、遷移以及新生血管的生成均具有促進作用，在評估內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖與分化情況時，通常采用纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗，實驗結(jié)果表明，Si-MDK能夠顯著減少血管的生成。下調(diào)lncRNA-SENCR后，MDK的表達顯著增強，另外，轉(zhuǎn)染siRNA實現(xiàn)干擾MDK表達，下調(diào)MDK的同時，發(fā)現(xiàn)SENCR的表達明顯上調(diào)，二者之間呈負(fù)相關(guān)[11]。下調(diào)lncRNA-SENCR能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移率，促進細(xì)胞的增殖，促進形成血管管腔，使毛細(xì)血管網(wǎng)的形成加速。

2.3 lncRNA參與調(diào)節(jié)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜炎性新生血管的生成炎癥因子對于細(xì)胞的遷移以及成管能力具有不同程度的促進作用，在lncRNA-MIAT對細(xì)胞成管能力影響的實驗研究中，MIAT刺激組與單純使用炎癥因子刺激組相比，刺激細(xì)胞的成管能力以及細(xì)胞遷移能力明顯降低[23]。在動物實驗中，通過下調(diào)MIAT能夠減少RNV形成，同時減輕炎癥反應(yīng)和血管滲漏的情況。與正常血管的形成比較，無功能新生血管的生成為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞受到環(huán)境中細(xì)胞因子和炎癥因子的刺激而發(fā)生增殖和遷移的過程[9]。另外，lncRNA-MALAT1能夠通過與核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的相互作用調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

位于編碼同源框轉(zhuǎn)錄因子腹前同源框2(ventral anterior homeobox 2，Vax2)基因反義鏈上的lncRNA-Vax2os主要有5種亞型。lncRNA-Vax2osl以及l(fā)ncRNA-Vax2os2在RNV形成的模型中呈現(xiàn)出異常表達，在伴有脈絡(luò)膜新生血管形成的患者房水中也呈現(xiàn)異常表達狀態(tài)。根據(jù)研究結(jié)果針對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點行預(yù)測檢查，發(fā)現(xiàn)這2種基因亞型以順式作用元件分別參與NF-κB和轉(zhuǎn)錄因子C-Rel在細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成過程中的致炎作用[25]。

母系印記基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)參與RNV的形成，通過實驗測定經(jīng)過氧化損傷處理的內(nèi)皮細(xì)胞中MEG3的表達水平，發(fā)現(xiàn)其明顯下調(diào)，通過敲除MEG3基因能夠使視網(wǎng)膜血管功能出現(xiàn)異常，增加炎癥反應(yīng)及血管的滲漏，敲除MEG3促進RNV管腔生成，這一過程主要受PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控[4]。

2.4 lncRNA參與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜血管內(nèi)血小板系統(tǒng)的激活實驗證明,在增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的玻璃體中PF4顯著上調(diào)[26]。在近期關(guān)于OIR模型的蛋白表達譜的研究中發(fā)現(xiàn)，在OIR小鼠眼內(nèi)有血小板系統(tǒng)被激活，進一步證明了在RNV形成過程中，在受損的血管壁附近，血小板被激活，促進PF-4的釋放[12]。另外PF-4對于巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB水平的增加有正向調(diào)節(jié)作用，促進基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)的轉(zhuǎn)錄。在血管重塑過程中，炎性細(xì)胞能夠作為血管組織MMP-9的重要資源，參與調(diào)控[27-28]。PF-4所屬半胱氨酸基元趨化因子家族，不僅具有阻止促血管生成因子與受體結(jié)合形成二聚體的作用，對于VEGF和單核細(xì)胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)的MAPK-ERK通路的活化也有一定的抑制作用，進而抑制新生血管的生成。SELP為血小板表面黏附分子，激活血小板能使SELP表達顯著上調(diào)，由此推斷，SELP有可能通過促進早期炎性單核細(xì)胞浸潤而加重缺血，進而誘導(dǎo)RNV的生成[12]。

3 lncRNA在ROP治療中的應(yīng)用與發(fā)展

ROP臨床治療主要采取玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物以及視網(wǎng)膜激光光凝治療，但大多數(shù)患者需要長期維持治療，并且有部分患者對注射抗VEGF藥物作用不明顯?；蛑委熞呀?jīng)被引入眾多學(xué)科中，與其他器官相比，眼部免疫作用比較薄弱，加之ROP發(fā)生與發(fā)展的時間窗比較短，這為基因治療提供了良好的條件。近期有研究表明，玻璃體內(nèi)注射Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)拮抗劑TAK-242可減少非滲出區(qū)域，抑制異常血管生成，并改善OIR小鼠視網(wǎng)膜的血管密度，TLR4-MAP4K4通路可以通過獨立于血管內(nèi)皮生長因子的機制調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜新生血管[29]。OIR狀態(tài)下血小板系統(tǒng)處于激活狀態(tài)，而促炎因子表達下調(diào)，表明PF-4可能成為針對RNV的VEGF非依賴型治療策略的新靶點[12]。此外，lncRNA-SENCR對血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的影響[11]、lncRNA-MIAT對miR-150-5p的競爭性吸附[17]、 lncRNA-MEG3調(diào)控VEGFR2的表達[30]以及FGF2與PI3K通路之間的作用關(guān)系等都為RNV生成的研究提供了新視角。

目前，關(guān)于lncRNA在ROP治療的研究中，有眾多先進的治療思路，均具有相應(yīng)的參考價值，多數(shù)新靶點的提出皆需要反復(fù)實驗來驗證。深入研究多種基因水平表達的內(nèi)源性血管生長抑制物，為ROP的臨床治療提供最佳治療方案是十分必要的。