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(1.重慶市中藥研究院,重慶 400065;2.重慶市中藥健康學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400065)

梁平柚又名梁山柚,屬于文旦柚的一種,清乾隆末期由福建省引入,在重慶梁平已有200多年栽培歷史。梁平柚果高肩平頂,果形美觀,色澤橙黃,皮薄光滑,油胞較細(xì),果皮芳香濃郁,是中國柚類平頂型柚的代表品種[1]。梁平柚果皮約占柚子鮮重的五分之一,其中外果皮約占柚子鮮重的9%,富含芳香性揮發(fā)性成分。與其它柚皮精油相似,梁平柚果皮精油不但具有柑橘類水果的芳香味,還擁有獨(dú)特的柚香味,具有祛痰、止咳、促進(jìn)消化、鎮(zhèn)痛、抗菌消炎等作用[2-4],作為一種天然香料廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)。

國內(nèi)外學(xué)者對柚皮精油進(jìn)行了深入研究,其中一些研究表明不同產(chǎn)區(qū)、不同品種和不同提取方法制備的柚皮精油在品質(zhì)方面存在一定的差異。洪鵬等[5]采用GC-MS法對琯溪蜜柚、沙田柚和梁平柚三種柚皮精油對比研究發(fā)現(xiàn):三種柚子精油的主要成分均為d-檸檬烯(476.150～741.595 μg/mL)、β-月桂烯(13.859～207.255 μg/mL),但琯溪蜜柚精油含有更高濃度的β-月桂烯,沉香醇以及醛類成分;張浩等[6]以沙田柚為研究對象,研究采用冷壓榨、水蒸汽蒸餾及機(jī)械磨皮三種方法制備的柚皮精油揮發(fā)性成分差異性,研究發(fā)現(xiàn):冷榨油的萜烯類、醛類、酯類組分的相對含量高于水提油和磨皮油,冷壓油對柚皮精油的呈香成分保留率更高;原鮮玲等[7]對廣西容縣、廣西桂林、廣西融水和福建4地沙田柚柚皮揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地柚果皮揮發(fā)油中有7個共有成分,但各成分含量在不同產(chǎn)地的柚果皮揮發(fā)油中有一定差別。經(jīng)多年田間觀察發(fā)現(xiàn),在梁平柚主產(chǎn)區(qū)同一果園內(nèi)不同樹齡柚皮精油的感官評價存在明顯差異性,但目前關(guān)于樹齡對梁平柚果皮精油揮發(fā)性成分組成影響的研究鮮見報道。

本研究以不同樹齡梁平柚果皮精油為研究對象,采用頂空固相微萃取法(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)萃取柚皮精油揮發(fā)性成分,結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)分析其組成,并運(yùn)用偏最小二乘法判別法(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和凝聚層級聚類法(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)兩種統(tǒng)計分析方法對其進(jìn)行組分差異分析,以期為梁平柚果皮精油差異化開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試的梁平柚果 均來自重慶市梁平區(qū)合興鎮(zhèn)龍灘村萬畝名柚園,分別選取土壤類型、地勢地貌、管理水平及樹冠內(nèi)密度等基本一致,樹齡分別為7～10、11～15、16～20、21～30和30年以上的梁平柚樹,每個樹齡隨機(jī)挑選10棵樹,分別從每棵樹中間冠層外圍采集1個果實(shí),每個樹齡采集10個,所選果實(shí)大小一致、無病害且成熟度相似。依次將5個樹齡段柚果設(shè)為N1、N2、N3、N4、N5組,每組10個樣品,分別為1～10號樣為N1組,11～20號樣為N2組,21～30號樣為N3組,31～40號樣為N4組,41～50號樣為N5組。果實(shí)無損運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后,于4 ℃保存至使用;正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品(C6～C20) 美國Sigma公司;氯化鈉(分析純) 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。

Agilent TD-GC/MS(7890A-5975C)型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;57330-U SPME手柄、75 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取纖維頭 美國SUPELCO公司;頂空萃取瓶 濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司;HJ-A4型數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取樣品制備 將剔去白皮層的柚皮切成2 mm的方塊,準(zhǔn)確稱取0.5 g,置于20 mL頂空萃取瓶中,加入3 mL純水,于高速分散器中處理2 min,加入1.05 g NaCl固體(形成NaCl飽和溶液),用聚四氟乙烯隔墊密封,于80 ℃水浴中平衡20 min后。將萃取頭插入250 ℃的GC進(jìn)樣口老化20 min,然后插入經(jīng)過平衡的裝有樣品的頂空萃取瓶中,于80 ℃下吸附40 min;再將萃取頭插入GC進(jìn)樣口,250 ℃解吸5 min。

1.2.2 GC-MS分析條件 色譜條件:色譜柱為RTX-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm×0.25μm);載氣為He,流速1 mL/min,分離比5∶1;進(jìn)樣溫度為250 ℃;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?0 ℃,保持5 min,以8 ℃/min,升至250 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:EI電離源,能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,接口溫度250 ℃,掃描范圍30～500 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

柚皮精油揮發(fā)性物質(zhì)利用GC-MS 聯(lián)用儀進(jìn)行鑒定,并根據(jù)C6～C20正構(gòu)烷烴的保留時間計算各個色譜峰的保留指數(shù),利用NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行初步檢索,選取相似度大于80%的揮發(fā)性成分,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8-13]的保留指數(shù)對比進(jìn)行定性分析,通過色譜峰面積歸一化法計算得各揮發(fā)性成分在不同樣品精油中的相對含量;應(yīng)用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和整理,利用SIMCA-P 14.0對5種不同樹齡梁平柚果皮精油中的揮發(fā)性成分進(jìn)行PLS-DA和HCA分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同樹齡梁平柚皮揮發(fā)性成分分析

通過GC-MS檢測分析,得到5種不同樹齡梁平柚果皮精油揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖,由圖1可知,本試驗(yàn)所使用的GC-MS條件能較好分離各揮發(fā)性成分,其差異主要出現(xiàn)在檢測時的5～30 min時間段。

圖1 不同樹齡梁平柚果皮精油 揮發(fā)性成分縱向疊加總離子流色譜圖Fig.1 Overlapped total ion current chromatograms of volatile components in peel of Liangping pomelo with different tree ages

5種不同樹齡梁平柚果皮精油中共分離檢測到72種揮發(fā)性化學(xué)成分,利用質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST08分別對各色譜峰進(jìn)行初步檢索及相關(guān)文獻(xiàn)參考定性,確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)名稱,其分析結(jié)果見表1。如表1所示,5種不同樹齡梁平柚果皮精油的揮發(fā)性成分中有8種成分較高(相對含量>1%),分別為d-檸檬烯(49.93%～54.93%)、β-月桂烯(18.55%～20.79%)、大根香葉烯 D(2.16%～3.66%)、檜烯(1.53%～3.20%)、β-蒎烯(1.33%～2.80%)、檸檬醛(2.52%～2.73%)、E-β-羅勒烯(1.49%～2.46%)、圓柚酮(1.01%～2.14%),共占總揮發(fā)性成分的83.40%～87.61%。本試驗(yàn)檢測出的d-檸檬烯和β-月桂烯相對含量與洪鵬等[5]的研究結(jié)果具有較大差異,洪鵬等通過擠壓法制備的梁平柚精油揮發(fā)性成分中d-檸檬烯為74.16%和β-月桂烯為13.86%,這種差異可能來源于實(shí)驗(yàn)柚果成熟度的差異或柚皮精油制備工藝的不同[14]。

表1 不同樹齡梁平柚果皮揮發(fā)性成分及相對含量Table 1 Volatile components and relative contents in peel of Liangping pomelo with different tree ages

續(xù)表

注:“-”為參考文獻(xiàn)[8-13]中未報道,同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

相關(guān)研究表明[15-17],柚皮精油的揮發(fā)性成分中d-檸檬烯、β-月桂烯、圓柚酮、α-蒎烯、β-蒎烯和芳樟醇為其主要香味成分。由表1可以看出,d-檸檬烯在不同樹齡梁平柚果皮精油中的相對含量較穩(wěn)定,無顯著差異性(P>0.05);N5組β-月桂烯相對含量(20.79%)顯著大于N1組(18.55%)(P<0.05),N2、N3和N4組無顯著差異(P>0.05),表明樹齡越大,柚皮的香甜脂氣味[18]越濃;圓柚酮能提供強(qiáng)烈的柚子橙子果香味[5],N4組中圓柚酮相對含量最高(2.14%),與其他測試組差異顯著(P<0.05);α-蒎烯和β-蒎烯具有松節(jié)油香味[3],在N1組中相對含量最高,分別為2.50%和2.80%,2種成分的相對含量隨樹齡的增長,均呈逐漸減少趨勢;芳樟醇具有花香、果香和濃郁草香味[3],在N1組中相對含量最高(2.22%),隨樹齡的增長其逐漸減少。

同時由表1可以看出,隨著樹齡的增長,柚皮精油揮發(fā)性成分中保留指數(shù)大于2000的揮發(fā)性成分相對含量逐漸增加,由N1的0.01%增長到N5的0.39%,孫浩等[9]研究發(fā)現(xiàn),這類成分在常溫下難以揮發(fā),對香氣幾乎沒有影響,但對柚皮精油的透明度和澄清度有負(fù)面影響,造成精油穩(wěn)定性降低。由此可見,不同樹齡梁平柚果皮中主要揮發(fā)性成分的相對含量具有較為顯著的差異(P<0.05),這種差異性可能來源于不同樹齡梁平柚樹生理代謝能力的強(qiáng)弱。

進(jìn)一步對檢測出的各揮發(fā)性成分進(jìn)行歸類,結(jié)果(表2)表明烯烴類化合物含量、種類豐富,是構(gòu)成梁平柚果香氣成分的主要物質(zhì),占總揮發(fā)性成分的85%以上;醇類、醛類、酮類化合物在揮發(fā)性成分中也占有較大比重,其相對含量均>1%。采用Duncan’s新復(fù)極差法對組間差異進(jìn)行分析,N5組的醛類、酮類、酯類及酸類等化合物相對含量顯著高于N1和N2組(P<0.05),N1和N2組的醇類化合物相對含量顯著高于N4和N5組(P<0.05),5個組的烯烴類無顯著差異性(P>0.05)。

表2 各揮發(fā)性成分的種類和相對含量Table 2 Varieties and relative contents of volatile components

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

在烯烴類化合物中,N5組不含莰烯、4-蒈烯、2-辛烯、雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、甘香烯、α-石竹烯等,N1組不含γ-萜品烯和p-傘花烴;(Z)-氧化芳樟醇、環(huán)戊-4-烯醇、薄荷-2,8-二烯-1-醇、(E)-2-已烯-1-醇、3-環(huán)己烯-1-醇、(E)-橙花叔醇、3,7,11-三甲基-6,10-十二烯-1-醇等醇類化合物未在N5組檢出;(Z)-己酸-3-己烯酯、甲基棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、亞麻酸等酸、酯類化合物未在N1組檢出。

結(jié)合表1和表2可以看出,在低樹齡段(7～10年),梁平柚果皮精油的揮發(fā)性成分含有較多的小分子芳香物質(zhì),如α-蒎烯、莰烯、α-水芹烯、4-蒈烯、2-辛烯、1,3,5-環(huán)庚三烯、2-辛烯等。隨著樹齡的增長,精油中芳香物質(zhì)不僅在富集,還在向更穩(wěn)定的化合狀態(tài)轉(zhuǎn)變,由小分子萜烯類化合物經(jīng)氧化成了留香較為持久、分子量較大的酮、酯等。另外,精油中揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量隨著樹齡的增長而有不同方向和程度的變化。如α-蒎烯、莰烯、檜烯、β-蒎烯、α-水芹烯、4-蒈烯、芳樟醇、薄荷-2,8-二烯-1-醇、L-香芹醇等芳香物質(zhì)隨著樹齡增長,其相對含量逐漸減少;蛇床子素、亞麻酸、9,12-十八碳二烯酸(反式亞油酸)、順式-9,12-十八碳二烯酸甲酯、正十六烷酸、甲基棕櫚酸等大分子芳香物質(zhì)隨著樹齡增長,其相對含量逐漸增加。這可能是因?yàn)橛讟淦?樹勢旺盛,養(yǎng)分供應(yīng)偏向于營養(yǎng)生長,果實(shí)果皮厚、風(fēng)味淡,隨著樹齡增大,樹勢趨于穩(wěn)定,樹體養(yǎng)分分配趨于平衡,枝葉的新陳代謝能力也較強(qiáng),因而果實(shí)趨于均勻,果皮變薄,風(fēng)味變濃[19]。由此可見,在品質(zhì)、產(chǎn)地和制備方法相同的條件下,柚皮精油的組成及揮發(fā)性成分相對含量都存在差異性。

2.2 偏最小二乘法判別分析

為進(jìn)一步研究不同樹齡梁平柚皮精油揮發(fā)性成分的差異性,對其進(jìn)行PLS-DA分析。PLS-DA分析法是一種集主成分分析、典型相關(guān)分析和多元回歸分析為一體的統(tǒng)計方法,通過降維處理將重復(fù)的變量(關(guān)系緊密的變量)刪去多余,建立盡可能少的新變量,使得這些新變量是兩兩不相關(guān)的,而且這些新變量在反映研究的信息方面盡可能保持原有的信息。

將試驗(yàn)中50個樣品按不同樹齡預(yù)先分組,通過SIMCA軟件構(gòu)建PLS-DA數(shù)學(xué)模型。由表3可知,PLS-DA模型包含5個主成分,前2個主成分累計方差貢獻(xiàn)率為69.7%,綜合了不同樹齡柚皮精油揮發(fā)性成分的大部分信息,可以較好說明該數(shù)據(jù)的變化趨勢。以不同樹齡柚皮精油揮發(fā)性成分在第1、2主成分上的得分作圖,主成分得分圖(圖2a)顯示5種不同樹齡梁平柚皮揮發(fā)性成分樣品均處于相對獨(dú)立的空間位置。在第1主成分平面上,可顯著區(qū)分(N1與N5、N2與N4、N1與N4、N2與N5、N1與N3、N3與N5)樣品,但對(N1與N2、N2與N3、N3與N4、N4與N5)樣品區(qū)分效果不明顯;在第2主成分平面上,可顯著區(qū)分(N1與N2、N2與N3、N4與N5)樣品,但對N3與N4組區(qū)分效果不明顯。載荷圖(圖2b)中各揮發(fā)性成分的分布情況與主成分得分圖中樣本點(diǎn)的分布位置相對應(yīng)。由此可見,PLS-DA可對不同樹齡梁平柚皮精油揮發(fā)性成分進(jìn)行一定的分類,說明其相對含量有著一定程度的區(qū)別。

表3 PLS-DA的特征值、貢獻(xiàn)率及預(yù)測能力Table 3 Eigenvalues,cumulative contribution and predication performance by PLS-DA

圖2 不同樹齡柚皮精油的主成分得分圖(a)和載荷圖(b)Fig.2 PLS-DA score plots(a)and loading plots(b)of essential oil of pomelo peel with different ages注:圖中a數(shù)字表示不同柚皮精油樣品;圖b表示不同揮發(fā)性成分。

圖3 不同柚皮精油樣品聚類樹狀圖Fig.3 Cluster dendrogram of essential oil samples from different pomelo peels

2.3 凝聚層級聚類分析

分別以50個梁平柚皮精油和72種鑒定出的揮發(fā)性成分相對含量為原始變量,進(jìn)行HCA分析,使品質(zhì)相近聚在一起,采用word 聚類方法,使用歐式距離來計算不同類別數(shù)據(jù)點(diǎn)間的距離(相似度),構(gòu)建50個梁平柚皮樣品及72種揮發(fā)性成分聚類樹狀圖。由圖3可知,50個梁平柚皮樣品在標(biāo)度為230時可聚類為3類,第1類包含N4組(31～40號樣)和N5組(41～50號樣)的20個樣品;第2類包含N3組(21～30號樣)合N2組(38號樣)的11個樣品;第3類包含N1組(1～10號樣)和N2組(21～27、29、30號樣)的19個樣品。由圖4可知,72種柚皮揮發(fā)性成分在標(biāo)度為0.49時可聚類為3類,第1類包含檸檬醛、d-檸檬烯、β-月桂烯、圓柚酮、α-法呢烯、蛇床子素等33種揮發(fā)性成分;第2類包含α-石竹烯、β-金合歡烯、大根香葉烯 B、乙酸香茅酯等11種揮發(fā)性成分;第3類包含α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、L-薄荷醇、芳樟醇等28種揮發(fā)性成分。結(jié)合PLS-DA得分圖和載荷圖,3類梁平柚皮樣品分別位于得分圖的左、中、右方位,而3類揮發(fā)性成分分別位于載荷圖的左、中、右方位。對比圖3及圖4結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCA分析與PLS-DA分析結(jié)果存在一致性,可相互印證、互為補(bǔ)充。

圖4 精油揮發(fā)性成分的聚類分析圖Fig.4 Cluster dendrogram of volatile components in essential oil

2.4 不同樹齡梁平柚皮特征揮發(fā)性物質(zhì)分析

結(jié)合PLS-DA的載荷圖和重要性變量因子(Variable important for the projection,VIP)值分析,可以找出區(qū)分不同樹齡柚皮精油揮發(fā)性成分的潛在標(biāo)志物。VIP值可以量化每個變量因子對分類的貢獻(xiàn)[20],VIP值越大,揮發(fā)性成分對不同樹齡柚皮精油樣品的差異貢獻(xiàn)越顯著。通過計算出的VIP值(表4),發(fā)現(xiàn)有21個揮發(fā)性成分VIP值大于1。

表4 不同樹齡柚皮揮發(fā)性成分中潛在標(biāo)志物(VIP>1)Table 4 Potential markers of volatile components in pomelo peel with different tree ages(VIP>1)

將HCA分析結(jié)果結(jié)合PLS-DA主成分得分圖和載荷圖中的VIP值(表4)可知,將3類梁平柚皮精油樣品區(qū)分開的特征揮發(fā)性成分為:乙酸香葉酯、正十六烷酸、L-紫蘇醇、蛇床子素、β-石竹烯、δ-蓽橙茄烯、β-欖香烯等7個成分為第Ⅰ類樣品的特征物。正十六烷酸、蛇床子素的油脂味[8]和乙酸香葉酯、L-紫蘇醇、β-欖香烯的草木味[17],使得這類柚皮精油具有強(qiáng)烈的草木油香味;(E)-2-已烯-1-醇、大根香葉烯 B、α-石竹烯、3-環(huán)己烯-1-醇、3,7,11-三甲基-6,10-十二烯-1-醇、β-金合歡烯等6個成分為第Ⅱ類樣品的特征物。這類柚皮精油因β-金合歡烯、α-石竹烯具有典型柑橘香甜味[10-11];L-薄荷醇、(Z)-香芹酮、3,4-二甲基-2-己醇等余下的8個成分為第Ⅲ類樣品的特征物,L-薄荷醇和(Z)-香芹酮使這類柚皮精油具有強(qiáng)烈的薄荷味。

圖5 主成分載荷圖Fig.5 Biplot of principal component analysis注:圖中“■”表示不同精油樣品,“●”表示VIP值>1的揮發(fā)性成分。

PLS-DA和HCA是兩種重要的多變量統(tǒng)計分析方法,將較多的變量利用降維處理為盡可能少的新變量,使得這些新變量是兩兩不相關(guān)的,同時歸納出潛在標(biāo)志物,目前其廣泛用于食品、藥品和農(nóng)產(chǎn)品等品質(zhì)差異性分析及親緣鑒定識別。劉彬球等[20]利用PCA和PLS-DA分析法對不同等級的曬青毛茶多項(xiàng)理化成分進(jìn)行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)茶葉中的氨基酸組分含量是曬青毛茶級別分類的重要理化成分,其中賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)起著較為顯著的作用;Lota 等[21]采用PCA和HCA分析法將15種寬皮柑橘歸納為3個化學(xué)類型:檸檬烯型、檸檬烯/γ-萜品烯型和乙酸芳樟酯/檸檬烯型;Pan 等[22]利用液相紫外檢測串聯(lián)質(zhì)譜研究了不同產(chǎn)地瑪咖的瑪咖酰胺含量差異,并根據(jù)PLS-DA模型區(qū)分了產(chǎn)地。本試驗(yàn)運(yùn)用HCA分析法將5個不同樹齡段梁平柚皮精油聚類為3類,根據(jù)特征性揮發(fā)物質(zhì)可將3類精油按香型分為草木油香味(N4和N5組),典型柑橘香甜味型(N3組),濃郁薄荷香型(N1和N2組)。

3 結(jié)論

梁平柚果皮富含豐富的芳香性揮發(fā)性成分,但不同樹齡段果皮精油揮發(fā)性成分的組成具有一定差異性。在低樹齡段精油中含有較多的小分子芳香物質(zhì);隨著樹齡的增長,酮、酯等留香較為持久、分子量較大的物質(zhì)逐漸增多,使不同樹齡段的柚皮精油呈現(xiàn)出不同的香型特征。因此,在梁平柚果皮精油的開發(fā)利用時,應(yīng)根據(jù)其精油組分的變化趨勢選擇合適的加工工藝及產(chǎn)品類型,進(jìn)行差異化開發(fā)利用。