李瑩瑩，孫冰冰，張廷廷，李松濤，趙紅玲，王汝興

（承德醫(yī)學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德 067000）

苦參為我國傳統(tǒng)中藥材，其主要化學成分為苦參堿，具有抗腫瘤、強心、抗炎、抗菌、免疫抑制等多種藥理作用［1］。目前，臨床上主要有栓劑、腸溶片、注射劑、膠囊劑等傳統(tǒng)劑型［2］。

固體脂質(zhì)納米粒是以毒性低、生物相容性好、穩(wěn)定性高、以生物可降解的固態(tài)天然或合成類脂為載體，與表面活性劑共同構(gòu)成不規(guī)則骨架，將藥物吸附或包裹于其中而制成的新型納米粒給藥系統(tǒng)［3-4］。納米粒是一種在室溫及體溫下為固態(tài)的膠狀微粒，平均粒徑50～1 000 nm，可控制藥物釋放、靶向傳遞，適合多種給藥途徑［5-7］，其所含的親脂性材料使藥物包裹于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中，可提高包封率和細胞透過率，從而增加細胞內(nèi)藥物濃度［8-9］，制備方法有高壓均質(zhì)法、微乳法、溶劑蒸發(fā)法、乳化蒸發(fā)-低溫固化法、熔融超聲法、高剪切乳化超聲法、溶劑注射法等［10］，其中超聲分散法制備苦參堿納米粒時操作簡單，易于控制，但所得納米粒穩(wěn)定性較差，振蕩后會產(chǎn)生白色絮狀物［11］；乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備時雖然穩(wěn)定性較好，但存在引入毒性有機溶劑、包封率不高等問題［12］。因此，本實驗采用高壓均質(zhì)法制備苦參堿固體脂質(zhì)納米粒，并通過正交試驗優(yōu)化其處方，為該成分臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 JA2003 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；JY92-ⅡN 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FSH-2 高速分散均質(zhì)機（常州市偉嘉儀器制造有限公司）；GT16-3 高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；ZEN3690 激光粒度儀（英國馬爾文公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；LGJ-22D冷凍干燥機（北京四環(huán)科學儀器廠有限公司）；AH-2010 高壓均質(zhì)機（ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 苦參堿對照品、原料藥（批號17061508）（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。吐溫-80（天津市化學試劑批發(fā)公司）；硬脂酸（天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參堿含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ODS C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相乙腈-磷酸二氫鉀（6∶94）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取苦參堿對照品3.0 mg，以“2.1.1”項下流動相定容于10 mL 量瓶中，得300.0 mg／mL 貯備液，流動相分別稀釋至6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg／mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y＝16.17X－14.531（r＝0.999 9），在6.25～200.0 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。色譜圖見圖1。

2.1.3 精密度試驗 取25.0、50.0、100.0 μg／mL對照品溶液，每天在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，每天1 次，考察日間精密度，測得兩者RSD 分別為0.14%、0.17%，表明該方法精密度良好。

圖1 苦參堿HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of matrine

2.1.4 加樣回收率試驗 精密量取208.0 μg／mL對照品溶液0.6、0.75、0.9 mL，各3 份，置于10 mL量瓶中，加入1 mL 空白納米粒溶液，流動相定容至刻度，得到12.48、15.60、18.72 μg／mL溶液，各3 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，苦參堿平均加樣回收率為101.06%，RSD 為0.01%。

2.2 包封率測定 精密吸取固體脂質(zhì)納米粒混懸液800 μL，置于超濾離心管中，10 000 r／min 離心30 min，取上清液20 μL，流動相定容至2 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算游離藥量W游離。另精密吸取0.5 mL，乙腈破乳后定容至50 mL 量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算總藥物量W總，計算包封率，公式為包封率＝［（W總－W游離）／W總］×100%。

2.3 苦參堿固體脂質(zhì)納米粒制備 精密稱取1.0 g硬脂酸、0.30 g 吐溫－80，80 ℃下加熱熔融作為油相；取純化水適量，加熱至85 ℃作為水相。精密稱取苦參堿0.2 g，超聲溶于水相中，1 300 r／min攪拌下將水相迅速加到油相中，繼續(xù)攪拌10 min，形成初乳，12 000 r／min 下高速分散5 min，高壓均質(zhì)機在90 MPa 壓力下作用40 個循環(huán)，冰浴過夜，即得。

2.4 粒徑、Zeta 電位測定［13］稱取適量苦參堿固體脂質(zhì)納米粒，室溫下純水稀釋，探頭超聲處理后激光粒度儀測定其粒徑、PDI 和Zeta 電位。結(jié)果，三者分別為90.41 nm、0.303、－24 mV。

2.5 正交試驗 根據(jù)預試驗和單因素試驗結(jié)果，以吐溫-80 用量（A）、均質(zhì)壓力（B）、藥脂比（C）為影響因素，包封率為評價指標，采用L9（34）正交設計表安排試驗。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設計與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表可知，各因素對包封率均有顯著影響（P＜0.05，P＜0.01），影響程度依次為C＞A＞B；最優(yōu)處方為A3B2C2，即吐溫-80 用量0.3 g，均質(zhì)壓力90 MPa，藥脂比1∶5。

按優(yōu)化處方制備3 批固體脂質(zhì)納米粒，測得包封率分別為95.02%、94.94%、92.49%，平 均（94.15±1.44）%，表明工藝穩(wěn)定可行。

3 討論與結(jié)論

高壓均質(zhì)法是超微細化液體物料或以液體為載體的一種新技術(shù)，它可使物料細化為微米級至納米級［14］，在制藥工業(yè)中廣泛用于制備脂質(zhì)體、納米粒、微乳等劑型，其核心應用設備為高壓均質(zhì)機。一般來說，高壓均質(zhì)機均質(zhì)壓力越大，均質(zhì)循環(huán)次數(shù)越多，則原料粒徑越小。

課題組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，硬脂酸固體脂質(zhì)在高壓均質(zhì)機內(nèi)進行均質(zhì)時，沒有立即堵塞高壓均質(zhì)機管道，故可進行操作。本實驗對吐溫-80 用量、剪切機轉(zhuǎn)速、均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、溫度、溶劑用量等因素進行了考察，發(fā)現(xiàn)在使用高壓均質(zhì)機前以熱水預熱時，所得納米粒的粒徑和PDI 較小，而在常溫下恰好相反；考察藥脂比時發(fā)現(xiàn)，熱水預熱后高壓均質(zhì)機所得納米粒的粒徑均小于100 nm，表明熱勻法制備效果更好。

在單因素試驗中以粒徑和Zeta 電位為評價指標，考察處方和工藝對納米粒的影響，然后在此基礎上采用正交試驗優(yōu)化最終處方。結(jié)果，優(yōu)化處方所得納米粒的粒徑和Zeta 電位變化不大，而處方變化對包封率影響較大，其原因可能是由于這會改變納米粒與苦參堿的親和力，進而影響了對該成分的包封效果，而高壓均質(zhì)機具有較強的機械力，可消除正交試驗范圍內(nèi)的粒徑變化。因此，在正交試驗中只選擇包封率作為評價指標，最終優(yōu)化處方也印證了該結(jié)果。

與以往文獻報道比較，雖然本實驗也制備了苦參堿固體脂質(zhì)納米粒，但由于采用高壓均質(zhì)法，故粒徑較小，分布較均勻，包封率較高，同時避免了向體系內(nèi)加入毒性較大的有機溶劑，以及因超聲法分散時間過長而引起的金屬污染等問題，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有一定應用前景。