赫一鳴，劉 鑫，王玥玥，曹 雪，貢濟宇，蔡廣知

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

車前子為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥成熟種子［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［2］，其味甘，具有清熱利尿通淋、滲濕止渴、明目、祛痰的功效，用于熱淋濕痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽等癥狀的治療［3-4］。炒車前子為車前子清炒后的炮制品，對便秘具有良好療效［5］，并可增強生品清熱利尿、腎濕通淋的作用［6］。

2015 年版《中國藥典》一部收載了腎炎解熱片、八正合劑、金花明目丸、除濕白帶丸、益腎靈顆粒等含有炒車前子的中成藥，廣東、河南、上海等地在炮制規(guī)范中以車前子為炒車前子質(zhì)控指標，不能體現(xiàn)該藥材炒制前后各項指標的變化。因此，本實驗參考藥典及相關(guān)文獻，采用TLC、HPLC 法分別對炒車前子中主要活性成分京尼平苷酸和毛蕊花糖苷進行定性鑒別、定量分析，從性狀、鑒別、檢查方面進行系統(tǒng)研究［7］，以期更好地控制該藥材質(zhì)量，保證臨床療效［8］。

1 材料

DGG-9030 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；電子天平（萬分之一、十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；LC-2030 高效液相色譜儀（日本島津公司）。京尼平苷酸（批號111828-201604）、毛蕊花糖苷（批號111530-201713）對照品購于中國食品藥品檢定研究院。10 批車前子購于宏檢大藥房等地，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定教研組蔡廣知副教授鑒定為正品，具體見表1。甲醇為色譜純（美國Fisher 公司；水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 炒制品制備［9］取適量凈藥材于炒制容器中，用文火炒至略有爆聲、有香氣溢出時取出，晾涼，即得。

2.2 性狀特征 本品呈橢圓形、不規(guī)則長圓形或三角狀長圓形，略扁［7］；一面有灰白色凹點狀種臍，長（2±0.5）mm，寬（1±0.3）mm，表面有細皺紋，顯黃棕色至黑褐色［1］；質(zhì)硬，氣焦香。

2.3 TLC 定性鑒別

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷、京尼平苷酸對照品各1 mg，甲醇制成1 mg／mL，即得［1］。

2.3.2 供試品溶液制備 取本品粗粉1 g，10 mL甲醇超聲30 min，濾過，蒸干，殘渣加2 mL 甲醇溶解，即得［1］。

2.3.3 鑒別方法 采用2015 年版《中國藥典》薄層色譜法（通則0502）。吸取對照品、供試品溶液各5 μL，點于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（18∶2∶1.5∶1）為展開劑，置于254 nm 紫外燈下觀察，發(fā)現(xiàn)供試品色譜在對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點［1］；以0.5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，105 ℃下加熱至斑點清晰可見，也發(fā)現(xiàn)上述情況［9-10］。見圖1。

圖1 炒車前子TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of Plantaginis Semen Tostum

2.4 檢查

2.4.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分 采用2015年版《中國藥典》四部方法測定［11］，結(jié)果見表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分、膨脹度測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of water，total ash，acid-insoluble ash and turgidity（n＝3）

2.4.2 膨脹度 稱取本品1 g，采用2015 年版《中國藥典》膨脹度測定法（通則2101）測定［1］，結(jié)果見表2。以水分、總灰分、酸不溶性灰分平均含有量的120%，膨脹度的80%制定限度，暫定前三者分別不超過0.032%、5.2%、0.52%，后者不低于3.9［12］。

2.5 含有量測定

2.5.1 對照品溶液制備［1］精密稱取毛蕊花糖苷、京尼平苷酸對照品適量，置于棕色量瓶中，60%甲醇制成1 mg／mL，即得。

2.5.2 供試品溶液制備［1］取本品粉末（過2 號篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h 后放冷，60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件［1］Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，2.5 μm）；流動相甲醇（A）-［醋酸-水（0.5∶100）］（B），梯度洗脫（0～1 min，5% A；1～40 min，5%～60% A；40～50 min，60%～5% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖2。由此可知，色譜峰分離度良好，陰性無干擾，理論塔板數(shù)按京尼平苷酸峰計不低于3 000。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC charomatograms of various constituents

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察［13］分別精密吸取含0.016、0.032、0.063、0.127、0.254、0.508 mg／mL 京尼平苷酸，0.016、0.032、0.065、0.130、0.260、0.520 mg／mL 毛蕊花糖苷的對照品溶液，在“2.5.3”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷方程分別為Y＝6 891 949.924X－15 839.402 99（r＝0.999 3）、Y＝6 621 703.133X－28 736.930 35（r＝0.999 5），分別在0.793 75～25.400、0.812 5～26.00 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗［14-15］精密吸取同一供試品溶液10 μL，在“2.5.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得供試品溶液峰面積RSD 為1.6%，表明儀器精密度良好［15］。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗［16］精密吸取同一對照品、供試品溶液各10 μL，于0、2、4、6、8、10、12 h在“2.5.3”項色譜條件下進樣測定，測得對照品、供試品溶液峰面積RSD 分別為2.8%、2.1%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗 取同一批本品（批號180921），按“2.5.2”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.5.3”項色譜條件下進樣測定，測得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含有量RSD 分別為0.24%、0.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的本品6 份，精密加入適量對照品，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為99.5%、99.8%，RSD 分別為1.2%、2.5%。

2.7 樣品含有量測定 按“2.5.2”項下方法制備供試品（炒制前、炒制后）溶液，在“2.5.3”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表3。根據(jù)測定結(jié)果，結(jié)合2015 年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，暫定京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含有量分別不少于0.90%、0.55%。

表3 各成分含有量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

3 討論

車前子炒制后，京尼平苷酸含有量較生品升高35%，而毛蕊花糖苷升高38%，可能是炒制會破壞藥材中大量黏液質(zhì)，使有效成分易煎出［17］，具體有待進一步研究。另外，由于炒制后車前子種皮內(nèi)表皮、外表皮細胞被破壞，內(nèi)胚乳細胞蛋白質(zhì)變性，故不將顯微鑒別列入該藥材質(zhì)量標準中。

炒車前子作為常用藥材，目前尚無明確的炮制規(guī)范和質(zhì)量標準。本實驗所建立的炒車前子質(zhì)量標準可操作性強，能指導(dǎo)炮制品規(guī)范化生產(chǎn)，為保證其臨床療效提供依據(jù)，也對監(jiān)督相關(guān)藥物質(zhì)量有著重要意義。