宋宇塵，雷 爽*，韓新民，袁海霞，周榮易，劉 睿

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023； 3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）為兒童期發(fā)病特別是學齡期兒童常見的心理行為障礙性疾病，其主要特征是與年齡不相符的注意力不集中、多動、沖動［1］。本病與成年高犯罪率有關，持續(xù)到成年的ADHD 可伴隨更加嚴重的心理行為障礙且更難治療，嚴重影響患者的健康成長、家庭和睦及社會和諧。ADHD 的發(fā)病機制尚未明確，學術界認可的假說中“多巴胺（dopamine，DA）缺陷理論”的接受度和討論度最高［2］。哌甲酯和托莫西汀為當前治療ADHD 的一線藥物，但因其不良反應使接受度較低，限制了廣泛應用。中醫(yī)藥治療ADHD 因臨床療效確切、遠期療效好、不良反應少，近年來受到患兒家長的肯定和歡迎。南京中醫(yī)藥大學韓新民教授的經(jīng)驗方安神定志靈是依據(jù)多部中醫(yī)古代兒科著作相關理論及30 多年治療兒童多動癥的經(jīng)驗創(chuàng)制而成，臨床對照研究證實了安神定志靈對ADHD 心肝火旺證的積極作用［3］。課題組前期研究表明復方安神定志靈能夠升高SHR大鼠前額葉與紋狀體DA 水平，調(diào)節(jié)DA 受體功能［4-6］。但DA 系統(tǒng)十分復雜，DA 的合成、清除等環(huán)節(jié)障礙均可能導致ADHD 的發(fā)生。課題組前期對SHR 大鼠腦突觸體DA 合成相關因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)安神定志靈可以通過控制DA合成速度發(fā)揮對核心癥狀的療效［7］。前額葉皮質(zhì)在注意力和工作記憶的功能至關重要［8］，基于以上前提，為進一步探討安神定志靈的作用機制，課題組以前額葉皮質(zhì)DA 合成關鍵因子酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）及清除關鍵因子多巴胺轉(zhuǎn)運體（dopamine transporter，DAT）為切入點，探究經(jīng)驗方安神定志靈的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）大鼠40 只，雄性WKY 大鼠8 只，雄性SD 大鼠8 只，3 周齡，體質(zhì)量（76.7±7.3）g，生產(chǎn)許可證SCXK（京）2012-0001，動物飼養(yǎng)設施許可證號SYXK（蘇）2014-0001，動物倫理審查批準編 號ACU170803。大鼠自由飲食進水，適應性飼養(yǎng)7 d［9］。

1.2 藥物 所用同批次中藥購自南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂中藥房，且由南京中醫(yī)藥大學中藥資源學教研室主任巢建國教授鑒定為正品，全方12 味中藥飲片藥用部位及產(chǎn)地、批號見表1。中藥煎劑根據(jù)前期研究的水提取方法制備，以保證藥物有效成分的足量析出［10］。采用負壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至1.78 g／mL（高劑量），用生理鹽水把濃縮藥液稀釋為0.45、0.89 g／mL（低、中劑量）。鹽酸托莫西汀膠囊（擇思達，strattera，美國LILLY DEL CARIBE Inc 公司，進口藥品注冊證號H20110150，40 mg／片），加生理鹽水配置成0.67 mg／mL 混合液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。每日恢復至室溫并搖勻后，灌胃使用。

1.3 儀器 MM400 球磨儀（德國Retsch 公司）；5427R 離心機（德國Eppendorf 公司）；Shandon 全自動染色機（美國Thermo 公司）；Trans-Blot SD 型蛋白半干轉(zhuǎn)印儀、Chemi-Doc MP 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；Tissue-Tek-VIP6 型全自動真空組織脫水機（日本Sakura 公司）；Histostar 包埋機、Finesse E＋手動切片機（美國Thermo 公司）；Light Cycle 型DNA 熒光定量分析儀（瑞士Roche 公司）；Quantsdudio7 型熒光PCR 儀（美國Life 公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

表1 安神定志靈藥物組成

1.4 試劑 β-actin 抗體（英國Abcam 公司，貨號ab5694）；Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody（英國Abcam公司，貨號ab112）；Anti-Dopamine Transporter antibody（英國Abcam 公司，貨號ab111468）；BCA 試劑盒（美國Thermo 公司，批號23227）；ECL 化學發(fā)光底物（美國Thermo 公司，批號32109）；PBS 緩沖液（每1 L 中含8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，pH 調(diào)至7.4）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號9109、RR036A、RR820A）。1.5 Real-time PCR 引物合成 引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表2。

表2 引物序列

2 方法

2.1 給藥、分組 將40 只SHR 大鼠根據(jù)開場實驗總運動距離以隨機數(shù)字表法分為5 組，每組8 只，即模型組，擇思達組（0.045 mg／kg），安神定志靈低、中、高劑量組（6.7、13.4、26.7 g／kg）（安神定志靈中劑量等同于臨床等效劑量），另將8 只WKY 大鼠設為正常組1，8 只SD 大鼠設為正常組2，用藥劑量根據(jù)體表面積法換算而得［11］。適應性飼養(yǎng)后每日早8：00 稱重，各組大鼠灌胃體積均為1.5 mL／100 g，正常組1、2 及模型組均用生理鹽水灌胃，2 次／d，持續(xù)28 d。

2.2 樣品采集 末次給藥后禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，處死動物，剝開顱骨，取腦，快速于冰上分離前額葉，保存至－80 ℃冰箱。

2.3 Western blot 法檢測前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達 前額葉組織50～80 mg 加入RIPA 裂解混合液（含PMSF）1 mL，于球磨儀裂解30 min，參考課題組前期實驗步驟進行實驗操作［7］。一抗稀釋度分別為兔源TH 一抗（1∶200）、兔源DAT 一 抗（1∶1 000）、羊抗兔二 抗（1∶3 000），曝光。Image Lab 5.1 軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示其相對表達量。

2.4 Real-time PCR 檢測前額葉皮質(zhì)TH、DATmRNA 表達 按照實驗操作步驟提取前額葉總RNA，分析純度后逆轉(zhuǎn)錄，檢測濃度，96 孔板加樣，離心10 min，注意避光，放入熒光PCR 儀進行實時熒光定量PCR 實驗，擴增條件95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，循環(huán)40 次；反應條件37 ℃15 min，85 ℃5 s，描繪溶解曲線，重復3 次，對RQ值進行統(tǒng)計分析。

2.5 免疫熒光法檢測前額葉皮質(zhì)TH、DAT 表達 每組隨機選取大鼠3 只，末次給藥后禁食12 h，麻醉后分離心臟，在右心耳剪一小口，從心尖用4%多聚甲醛溶液灌注固定，灌注結(jié)束后剝離顱骨，取出腦組織，置4 ℃、4%多聚甲醛中固定12 h 以上，于高濃度蔗糖溶液中沉底。石蠟切片脫蠟至水，用PBS 洗3 次，5 min／次，抗原修復，用3%H2O2（溶劑為PBS）溶液室溫封閉10 min，雙蒸水洗滌，PBS 洗1 次，除去多余液體，滴加一抗，室溫下孵育1 h，PBS 洗3 次，5 min／次，滴 加1∶200 稀釋的 Alexa Fluor488、594 熒光標記二抗體，室溫避光作用1 h，傾去多余的二抗，PBS 緩沖液漂洗2 次，5 min／次，加入DAPI室溫作用5～10 min，抗淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad 6 統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析進行組間比較，分別與正常組1、正常組2、模型組、擇思達組進行兩兩比較，采用LSD-t、Dunett-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達 灌胃28 d后，與正常組1、2 比較，模型組TH 蛋 白表達降低（P＜0.05），DAT 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，擇思達組、復方安神定志靈低劑量組TH 蛋白表達升高（P＜0.05），擇思達組、復方安神定志靈中劑量組DAT蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 復方安神定志靈對大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達的影響（n＝8）

3.2 各組大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DATmRNA 表達 灌胃28 d后，與正常組1、2 比較，模型組THmRNA 表達水平降低（P＜0.05），DATmRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，擇思達組、復方安神定志靈低劑量組THmRNA 表達水平升高（P＜0.05），擇思達組、復方安神定志靈中劑量組DATmRNA 表達水平降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 復方安神定志靈對大鼠前額葉皮質(zhì)TH、 DAT mRNA 表達的影響（n＝8）

3.3 各組大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達 灌胃28 d后，與正常組1、2 比較，模型組TH 蛋白表達降低（P＜0.05），DAT 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，擇思達組及復方安神定志靈低劑量組TH 蛋白表達升高（P＜0.05），擇思達組及復方安神定志靈中劑量組DAT 蛋白表達降低（P＜0.05），兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3～5。

圖3 復方安神定志靈對大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT 蛋白表達的影響（n＝8）

圖4 復方安神定志靈對SHR 大鼠前額葉TH 陽性細胞表達的影響（×400）

圖5 安神定志靈對SHR 大鼠前額葉DAT 陽性細胞表達的影響（×400）

4 討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、對兒童教育要求的提高，ADHD越來越受到家庭、學校和社會的重視，推進了本病的研究。ADHD 病因病理尚未明確的現(xiàn)狀和其動物模型問題互為因果，是國內(nèi)外學者廣泛面對的難題，阻礙了本病的研究進展。SHR 大鼠是迄今國內(nèi)外圍繞ADHD 基礎研究認可度最高的動物模型［12］，SHR 大鼠由WKY 大鼠培育而來，在5周齡前無高血壓的混雜效應，而具有ADHD 的主要行為學表現(xiàn)。因ADHD 是根據(jù)癥狀診斷的疾病，SHR 行為學表現(xiàn)與本病臨床表現(xiàn)的高相似度提示SHR 可作為良好的ADHD動物模型。SHR 大鼠擁有多動、沖動、注意力不集中的典型ADHD 臨床表現(xiàn)（表面效度）；在ADHD 易感基因、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、大腦容量等方面與已被證明的ADHD 理論相符，與ADHD 患兒相似，SHR 大鼠也顯示出性別差異，且用于治療ADHD 的一線藥物哌甲酯、托莫西汀對SHR 大鼠有效（結(jié)構效度）；SHR 大鼠能夠預測臨床上尚未闡明的行為、遺傳和神經(jīng)化學等相關因素（預測效度）。SHR 大鼠源自WKY 大鼠，二者有相同的遺傳背景，因此WKY 鼠用作SHR 的正常對照［13-14］。但近年來有研究發(fā)現(xiàn)WKY 大鼠在行為學實驗中活動速度慢，靜止時間長，表現(xiàn)出抑郁樣特征［15］，作為正常對照的嚴謹性還值得商榷。因此本研究中設WKY 組、SD 組分別為正常組1、正常組2，SHR 為模型組，探討WKY、SD、SHR 大鼠DA 合成、清除相關因子表達的差異及藥物對上述過程的作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA 在前額葉皮質(zhì)的功能發(fā)揮中具有重要意義，其水平異?？梢娪诙喾N精神神經(jīng)疾病。DA 代謝的遺傳失衡在ADHD 發(fā)生中的作用已被包括多巴胺活性藥物的有效應用及功能性腦成像等研究所證實，“DA 缺陷理論”是目前ADHD 研究領域幾乎公認的ADHD 發(fā)生假說，也是國內(nèi)精神神經(jīng)疾病的研究熱點［16-18］。DA 在腦內(nèi)生成首先需要TH 催化酪氨酸生成，多巴再被多巴脫羧酶催化，脫去羧基形成DA。TH 在此過程中，是參與反應的起始酶及限速酶，因此TH 在生物體內(nèi)表達的異常會直接影響到兒茶酚胺類遞質(zhì)的合成［19］。TH 在一些中樞和周圍神經(jīng)元群以及腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞限制性表達。據(jù)人類基因組變異數(shù)據(jù)庫記錄顯示有41 種疾病由TH 基因點突變引起［20］。DA主要通過再攝取的方式進行清除，所釋放的DA 中的75%會通過DAT 再攝取，DAT 是位于多巴胺神經(jīng)元突觸前膜特異性的跨膜蛋白，屬于Na＋／Cl－離子依賴型轉(zhuǎn)運蛋白基因家族，可使DA 在突觸擴散之前迅速滅活。DAT 與TH、多巴胺D2 受體共定位，表明DAT 是特異性地表達在多巴胺能神經(jīng)元中。傳統(tǒng)觀念認為，DAT 的作用是攝取細胞外的DA至細胞內(nèi)［21］。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，DAT 重攝取的反應速率與胞外DA 濃度不相匹配，可能的解釋是DAT 的構象在向胞內(nèi)開口的時候，DA 可以通過DAT 釋放到胞外［22］。

近年來中醫(yī)藥對ADHD 的研究逐漸深入［23］，心肝火旺證是ADHD 實證最常見的證型［24］，安神定志靈是韓新民教授治療兒童多動癥心肝火旺證的經(jīng)驗方，臨床應用30 余年，其對ADHD 心肝火旺證取得了穩(wěn)定療效［3］。此方中黃芩清心平肝；醋柴胡、郁金、決明子行氣解郁，清肝平肝，并能使熱從大腸而下；天竺黃清熱豁痰，涼心定驚；炙遠志化痰寧心，安神益智；鉤藤平肝清熱平肝，熄風定驚；石菖蒲豁痰開竅，兼能醒神益智。諸藥合用使心火得清，肝陽得平，痰濕得除，神得安志得定，陰陽得平。在本次實驗中，增加了SD 大鼠這一正常對照組，使原本飽受爭議的SHR 大鼠和WKY 大鼠的對比增加了可靠性。本次實驗發(fā)現(xiàn)，在DA 合成及清除相關因子TH 和DAT 的表達上，WKY 大鼠與SD 大鼠相比未見明顯差異，而SHR 大鼠TH與DAT 蛋白及mRNA 表達與WKY 大鼠及SD 大鼠相比均有顯著差異，說明SHR 大鼠與WKY 大鼠這一經(jīng)典模型-正常對照在此方面基本符合要求。但未進行行為學實驗評價大鼠的自主活動及注意力等，ADHD 的模型動物及對照動物選擇仍需要更深層次的研究。本次實驗發(fā)現(xiàn)安神定志靈可能通過升高前額葉TH 蛋白及mRNA 表達及降低DAT 蛋白及mRNA 表達，以促進DA 合成及抑制DA 清除而提高DA水平來達到治療ADHD 的目的。且發(fā)揮作用的劑量組與擇思達組比較未見顯著差異（P＞0.05）。但安神定志靈低劑量組對TH 表達的調(diào)控較優(yōu)，而安神定志靈中劑量組對DAT 表達的調(diào)控較優(yōu)。提示安神定志靈的療效發(fā)揮未呈劑量依賴，其原因還需進一步探索。免疫熒光結(jié)果顯示，TH、DAT 陽性細胞在前額葉皮質(zhì)顯著表達，該區(qū)域在調(diào)控運動、空間時間記憶、注意力等功能上作用突出［8］。除前額葉外，紋狀體、海馬、杏仁核等區(qū)域也與ADHD 的發(fā)生相關，下一步需進行更加深入的研究。DA 系統(tǒng)十分復雜，除合成和清除外，其釋放機制也十分復雜，涉及DA 突觸囊泡循環(huán)等過程。這些問題，課題組將在下一步進行探索。