栗圣榕，謝 巧，廖 莉，顏成功，胡 攀，夏厚林*，張廷模*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.四川萬安石斛產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，四川 成都 610032；3.成都中草藥研究所，四川 成都 610041）

石斛首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。2015 年版《中國藥典》中將鐵皮石斛單列，石斛項(xiàng)下包括金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的栽培品及同屬植物的近似種，意味著同屬植物均可作為石斛藥材使用。《中國藥典》中鐵皮石斛項(xiàng)下規(guī)定其采收期為11 月至翌年3 月，而石斛項(xiàng)下對(duì)采收期的描述為全年均可采收［1］，各地方標(biāo)準(zhǔn)中大多未規(guī)定明確的采收期。由于過去野生石斛資源較為稀缺，全年均可采收的描述適用于隨遇隨采野生零散植株的情況?，F(xiàn)今多種石斛已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化種植，開展藥材采收期相關(guān)研究可保障藥材質(zhì)量，有利于石斛藥材種植的規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

疊鞘石斛為蘭科植物Dendrobium aurantiacumRchb.var.denneanum（Kerr.）Z.H.Tsi.栽培品的新鮮干燥莖，收載于2010 年版《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》和2015 年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》［2-3］，為西南地區(qū)主流的藥用石斛品種［4］，在四川、云南等多地實(shí)現(xiàn)規(guī)?；N植，疊鞘石斛采收期參照《中國藥典》規(guī)定制定，尚未見系統(tǒng)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采集了四川夾江不同生長期的11 批次疊鞘石斛樣品，測(cè)定了折干率，石斛酚、順式草木樨苷、多糖含有量，建立指紋圖譜等，以多指標(biāo)描述不同生長期藥材物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律，為確定適宜采收期提供依據(jù)。

1 材料

BS124S 電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；Agilent 1200 系列高效液相色譜儀（配置在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Chem Station 色譜數(shù)據(jù)工作站，美國安捷倫公司）；KQ-600DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

石斛酚對(duì)照品（成都德斯特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)170516-118，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）；順式草木樨苷對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）。乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；其他試劑均為分析純。

疊鞘石斛采自成都萬安石斛開發(fā)有限公司夾江種植場(chǎng)，按11 個(gè)時(shí)間采集莖條，混勻，參照文獻(xiàn)［5］方法（燀蒸法）進(jìn)行炮制，生長期及對(duì)應(yīng)采收時(shí)間見表1，樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為蘭科石斛屬植物疊鞘石斛Dendrobium aurantiacumvar.denneanum（Kerr.）Z.H.TSI.。

2 方法與結(jié)果

2.1 折干率測(cè)定 分別稱定炮制前后藥材質(zhì)量（M1、M2），計(jì)算折干率，公式為折干率＝（M2／M1）×100%，結(jié)果見表1。

2.2 石斛酚含有量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取石斛酚對(duì)照品5.16 mg，加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.516 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取疊鞘石斛粉末（過100目篩）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入70% 甲醇30 mL，超聲（40 kHz）提取1 h，濾過，濾液減壓濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸（36∶63）；體積流量1 mL／min；檢測(cè)波長280 nm；進(jìn)樣量20 μL；采集時(shí)間35 min。供試品、對(duì)照品色譜圖見圖1。

圖1 石斛酚HPLC 色譜圖

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液用70%甲醇稀釋為1、2、5、10、20、50、100、200 μg／mL的溶液，分別吸取20 μL，在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程為Y＝16.928X＋6.7131（r＝0.999 9），表明石斛酚在1.03～206.4 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得石斛酚峰面積RSD 為1.28%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，制備供試品溶液共6 份，在“2.2.3”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣，測(cè)得石斛酚峰面積RSD 為1.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，在“2.2.3”項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1 次，測(cè)得石斛酚面積RSD 為1.81%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取石斛酚含有量已知樣品9 份，每份約0.25 g，3 份為1 組，每組分別50%、100%、150%水平添加對(duì)照品，制備供試品溶液，測(cè)得石斛酚平均加樣回收率為100.57%，RSD 為1.55%。

2.2.5 樣品含有量測(cè)定 取各批樣品，在“2.2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定。結(jié)果見表1。

2.3 順式草木樨苷含有量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取順式草木樨苷對(duì)照品4.90 mg，加70% 甲醇制成質(zhì)量濃度為0.490 mg／mL 的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，加70%甲醇稀釋至10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 色譜條件 Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸（7∶93）；體積流量1 mL／min；檢測(cè)波長262 nm；進(jìn)樣量20 μL；采集時(shí)間35 min。對(duì)照品、供試品色譜圖見圖2。

圖2 順式草木樨苷HPLC 色譜圖

表1 樣品信息及各成分含有量測(cè)定結(jié)果

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液用70%甲醇稀釋為5、10、20、50、100、200、500 μg／mL，分別吸取20 μL，在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程為Y＝23.85X＋32.402（r＝0.999 9），表明順式草木樨苷在4.9～490 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得順式草木樨苷峰面積RSD 為1.38%，表明該儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，制備供試品溶液共6 份，在“2.2.3”項(xiàng)條件下分別進(jìn)樣，測(cè)得順式草木樨苷峰面積RSD 為1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，在“2.2.3”項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1 次，測(cè)得順式草木樨苷峰面積RSD 為1.06%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取順式草木樨苷含有量已知樣品6 份，每份約0.25 g，按100%水平加入對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得順式草木樨苷平均加樣回收率為100.57%，RSD 為1.56%。

2.3.5 樣品含有量測(cè)定 取各批樣品，在“2.2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定。結(jié)果見表1。2.4 多糖含有量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取葡萄糖對(duì)照品9.74 mg，制成質(zhì)量濃度為97.4 μg／mL 的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液制備 精密稱取疊鞘石斛粉末（過100 目篩）0.5 g，置于500 mL 圓底燒瓶中，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL 量瓶中，洗滌后加水稀釋定容，濾過，精密吸取1.5 mL 續(xù)濾液置于15 mL 離心管，精密加入無水乙醇7.5 mL，搖勻，冷藏放置1 h，取出離心20 min（轉(zhuǎn)速4 000 r／min），棄去上清液，沉淀用9 mL 80%乙醇洗滌2 次，離心，棄去上清液，熱水溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

2.4.3 方法學(xué)考察

2.4.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，各加水補(bǔ)至1 mL，精密加入5%苯酚1 mL，搖勻，精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，在488 nm 波長下測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程為Y＝1.00×10－2X＋2.54×10－4（r＝0.999 0），在9.74～87.66 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在488 nm 波長下分別于0、0.5、1.0、1.5、2 h測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為0.72%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在488 nm 波長下測(cè)定吸光度，連續(xù)6 次，測(cè)得其RSD 為1.38%，表明儀器精密度良好。

2.4.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，制備供試品溶液共6 份，以相應(yīng)試劑為空白，在488 nm 波長下測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為2.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.5 mL于10 mL 具塞試管中，加入0.5 mL 葡萄糖對(duì)照品，共6份，以相應(yīng)試劑為空白，在488 nm 波長下測(cè)定吸光度，測(cè)得多糖平均加樣回收率為100.05%，RSD 為1.50%。

2.4.4 樣品含有量測(cè)定 取各批次樣品，在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算多糖含有量。結(jié)果見表1。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 供試品溶液制備 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取2 種對(duì)照品適量，甲醇制成含順式草木樨苷0.245 mg／mL、石斛酚0.258 mg／mL 的溶液，即得。

2.5.3 色譜條件 Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，3%～13% A；7～15 min，13%A；15～22 min，13%～17% A；22～30 min，17% A；30～40 min，17%～23% A；40～50 min，23% A；50～84 min，23%～50% A，84～90 min，50%～3% A）；體積流量1 mL／min；檢測(cè)波長280 nm；進(jìn)樣量20 μL；采集時(shí)間90 min。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得相似度均大于0.98，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均＜0.5%，共有峰峰面積RSD 均＜3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，在“2.2.3”項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1 次，測(cè)得相似度均＞0.98，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均＜0.5%，共有峰峰面積RSD 均＜3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次藥材，制備供試品6份，在“2.2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定，測(cè)得相似度均大于0.98，相對(duì)保留時(shí)間RSD 均＜0.5%，共有峰峰面積RSD 均＜3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 指紋圖譜建立 取不同批次樣品依法測(cè)定，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版）”進(jìn)行處理，以DQ1 為參照?qǐng)D譜，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰進(jìn)行Mark 峰匹配，11批樣品指紋圖譜見圖3，共有模式見圖4。由此可知，共有峰有14 個(gè)，采用混合對(duì)照品保留時(shí)間定位，可指認(rèn)出2個(gè)，即順式草木樨苷（4 號(hào)峰）和石斛酚（13 號(hào)峰）。相似度見表1。

圖3 11 批樣品HPLC 指紋圖譜

3 結(jié)果

3.1 折干率、含有量測(cè)定，相似度與采收月份分析 DQ1、DQ2、DQ3 生長期小于12 個(gè)月，除順式草木樨苷含有量較高外，折干率、多糖均較低，石斛酚含有量未檢出；DQ4 采于次年2 月，生長期剛滿1 年，折干率、多糖均達(dá)峰值，順式草木樨苷含有量有所降低，石斛酚含有量較低；DQ5 采于次年7 月，夏季花期營養(yǎng)消耗，各指標(biāo)較DQ4 均有不同程度降低；DQ6 和DQ7 采于次年10 月，生長期20 個(gè)月，葉片尚未脫落，折干率降低，各指標(biāo)含有量均維持在相對(duì)較低水平；DQ8 采于第3 年2 月，生長期24個(gè)月，除石斛酚含有量近于中值外，折干率、順式草木樨苷、多糖含有量指標(biāo)均升至較高水平；DQ9、DQ10 采于第3 年7 月，花期剛過，各指標(biāo)均有一定程度的降低，與DQ6、DQ7 相近；DQ11 采于第3 年10 月，生長期超過30個(gè)月，折干率、多糖、順式草木樨苷均處于較低水平，但石斛酚含有量最高。

DQ1 至DQ4、DQ5 至DQ8 為不同生長年限的花期后至越冬期后（7 月至第2 年2 月），相似度皆呈增大趨勢(shì)，越冬期后相似度達(dá)最大；DQ4 至DQ5、DQ8 至DQ9（DQ10）為不同生長年限的花期前后采收，相似度皆降低；DQ8 至DQ11 的生長期為24 月至31 月，其相似度逐漸降低，至花期后的DQ11 相似度最小，僅0.553。

3.2 指紋圖譜與生長期關(guān)系的分析

3.2.1 聚類分析與主成分分析 將疊鞘石斛指紋圖譜各共有峰峰面積相對(duì)于稱樣量進(jìn)行量化并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，導(dǎo)入Matlab R2017a 中進(jìn)行聚類分析和主成分分析。聚類分析采用Weight 法，以歐式距離進(jìn)行聚類；主成分分析中前2 個(gè)主成分特征值累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到76%以上，可以表征指紋圖譜中的大部分信息。

圖5A 為藥材Q 型聚類分析樹狀圖和主成分得分圖的結(jié)合圖，距離在6 以上時(shí)所有樣品可以很明顯的被分為3類，第1 類包括DQ1～DQ3，第2 類包括DQ4～DQ10，DQ11 被單獨(dú)劃為1 類，主成分得分與系統(tǒng)聚類結(jié)果高度吻合，表明采收時(shí)間以第1 年11 月和第3 年7 月為節(jié)點(diǎn)可以被劃分為3 個(gè)階段，每階段內(nèi)的植株各成分比例穩(wěn)定，階段之間差異較大；圖5B 為14 個(gè)共有峰R 型聚類分析樹狀圖與主成分載荷結(jié)合圖，可以看出在距離1 以上時(shí)，14 個(gè)共有峰分為2 類，S2～S3、S11～S14 為1 類，其余為另1類，主成分載荷圖與系統(tǒng)聚類結(jié)果高度吻合，這2 類共有峰基本按照其化學(xué)極性分類，植株生長與石斛酚極性相近的化學(xué)物質(zhì)和與順式草木樨苷極性相近的化學(xué)物質(zhì)之間，含有量變化規(guī)律差異較大。

3.2.2 聚類熱圖分析 由圖6 可以看出，以4 號(hào)峰順式草木樨苷為代表的極性較大的成分含有量在采收期12 個(gè)月及以下的莖（DQ1～DQ3）中相對(duì)較高，但隨著生長期的增長逐漸降低；以13 號(hào)峰（石斛酚）為代表的極性相對(duì)較小的成分含有量則隨著生長期的增長逐漸變大，DQ4～DQ10在此范圍內(nèi)；DQ11 生長年限最長，極性小的成分含有量較高，極性大的較低。由此反映了“3.2.1”項(xiàng)下劃分不同采收階段中的植株化學(xué)成分間的差異，印證了其合理性。

3.3 適宜采收期的分析與確定 指紋圖譜提供的信息將疊鞘石斛采收時(shí)間劃分為3 個(gè)階段，結(jié)合折干率、含有量測(cè)定指標(biāo)、相似度，可以得出在第1 階段內(nèi)除順式草木樨苷含有量（苷類）外各指標(biāo)含有量均相對(duì)較低，不適宜采收；第3 階段內(nèi)雖然石斛酚含有量（聯(lián)芐類）達(dá)到頂峰，但其他指標(biāo)含有量均相對(duì)較低，不適宜采收；第1 階段內(nèi)第2 年春季（12 月至15 月）、第3 年春季（24 月至27 月）各指標(biāo)含有量一般相對(duì)較高，甚至處于峰值，但第2 年春季為新莖初次分蘗時(shí)期，過早采收會(huì)影響新莖的分蘗［6］，影響后續(xù)產(chǎn)量。由此確定，適宜在春季采收生長至第3 年的疊鞘石斛。

圖4 各指標(biāo)隨生長期變化散點(diǎn)圖

4 討論

石斛一般分布于秦嶺以南諸省，課題組查閱了相關(guān)地區(qū)中藥飲片炮制規(guī)范及中藥材標(biāo)準(zhǔn)與石斛相關(guān)的條目，《2014 年版浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》中對(duì)鐵皮石斛的采收期進(jìn)行了規(guī)定［7］，與2015 年版《中國藥典》中鐵皮石斛項(xiàng)下相同［1］，《2015 年版四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中石斛項(xiàng)下規(guī)定每年11 月至次年2 月采收生長3 年葉片脫落的莖［3］。其他各地如安徽、上海、貴州、廣西、浙江、江蘇等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范對(duì)石斛的采收期的描述均為全年均可采收或無明確描述［8-13］。

圖5 各樣品聚類分析與主成分分析結(jié)合圖

圖6 各樣品共有峰峰面積熱圖

對(duì)石斛采收期的科學(xué)研究也有一些報(bào)道，俞巧仙等［14］對(duì)鐵皮石斛不同采收期的多糖及浸出物進(jìn)行了測(cè)定，得出多糖在2 年生春季的枝條中較多。丁亞平等［15］對(duì)霍山石斛采收期進(jìn)行了確定，以增強(qiáng)免疫為目的時(shí)，將多糖含有量賦予了較高權(quán)重進(jìn)行綜合評(píng)分，發(fā)現(xiàn)第3 年采收指數(shù)最高。顏壽等［16］對(duì)合江金釵石斛的石斛堿和多糖進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)2 月中旬多糖含有量達(dá)到最高，結(jié)合生物堿含有量得出合江金釵石斛2 年生植株花期前的12 月至翌年1 月為最適宜采收期。楊莉等［17］測(cè)定了球花石斛中石斛酚、聯(lián)芐類、菲酚類等成分在不同采收期的含有量，在4～5 月、10～11月有所增加。楊虹等［18］對(duì)不同采收期鼓槌石斛中的酚類進(jìn)行了測(cè)定，主要包括聯(lián)芐類、菲及芴酮類，其含有量從4月開始升高，11 月達(dá)到最高，秋季均相對(duì)較高。綜上所述，文獻(xiàn)中各種石斛的采收期雖有差異，但一般集中在第2 年春季到第3 年秋季這段時(shí)間。本研究疊鞘石斛多糖與聯(lián)芐類的變化規(guī)律可與上述文獻(xiàn)描述相互印證，確定的最適采收期也在此區(qū)段內(nèi)。

本研究較全面地反映了不同采收期疊鞘石斛的物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律?！端拇ㄊ≈兴庯嬈谥埔?guī)范》中石斛項(xiàng)下規(guī)定的石斛品種為金釵石斛和疊鞘石斛［3］，本實(shí)驗(yàn)確定的疊鞘石斛的適宜采收期與其相符，可為該藥材規(guī)模化種植和采收提供參考。