趙培強(qiáng)，董四君

1. 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，中國科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門361021 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

自工業(yè)革命以來，一系列生態(tài)環(huán)境問題不斷地威脅著人類和其他生物的生存與健康。在保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)安全方面，世界各國的科學(xué)家們付出了巨大努力，在這個過程中，生態(tài)毒理學(xué)作為生態(tài)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和毒理學(xué)等學(xué)科交叉融合的一門綜合學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生?！吧鷳B(tài)毒理學(xué)”(Ecotoxicology)一詞是1969年6月由法國科學(xué)家薩豪特(Thuhaut R.)在一次國際會議上首次提出的[1]。有學(xué)者認(rèn)為，生態(tài)毒理學(xué)是通過研究化合物對環(huán)境中生物的影響，從而最終實(shí)現(xiàn)保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的目的[2]。生態(tài)毒理學(xué)作為毒理學(xué)的分支，具有廣泛的研究領(lǐng)域，從生態(tài)系統(tǒng)角度可以分為大氣生態(tài)毒理學(xué)、土壤生態(tài)毒理學(xué)、淡水生態(tài)毒理學(xué)和河口與海洋生態(tài)毒理學(xué)等。生態(tài)毒理學(xué)研究對象主要是非人類生物，在物種豐富的自然界，選擇合適的研究對象至關(guān)重要。在生態(tài)毒理學(xué)研究中，一般選擇可以反映不同營養(yǎng)級特征的多個物種或具有代表性的原生物種作為實(shí)驗(yàn)動物[3]。目前，在生態(tài)毒理學(xué)研究中常用實(shí)驗(yàn)生物有很多，如爬行動物中的蜥蜴[4]，魚類中的斑馬魚[5-7]、青鳉魚[8]，軟體動物中的河蜆[9]，節(jié)肢動物中的枝角類[10]，環(huán)節(jié)動物中的蚯蚓[11]，線蟲動物中的秀麗隱桿線蟲[12]等。已有綜述類文章就上述各種生物在生態(tài)毒理學(xué)中的研究進(jìn)展進(jìn)行了論述。

鹵蟲屬(Artemia)生物又名豐年蝦(brine shrimp)，作為基礎(chǔ)研究的實(shí)驗(yàn)動物已被廣泛應(yīng)用于水生生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、毒理學(xué)、放射生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究[3,13]。1956年，Michael等[14]在Science雜志上提出“由于鹵蟲對污染物的高度敏感性及其卵可以長期保存等特點(diǎn)，使其成為生物檢測中很好的實(shí)驗(yàn)生物”。此后，有多位學(xué)者就鹵蟲的生物學(xué)特征[15]、致死實(shí)驗(yàn)[16]及其在生物學(xué)中的應(yīng)用[17]等方面進(jìn)行了綜合論述。1987年，Sorgeloos等[18]就鹵蟲在毒理學(xué)中的研究與應(yīng)用進(jìn)行綜述，其中，將鹵蟲在水生毒理學(xué)中的研究整理成為了獨(dú)立章節(jié)。2006年，Nunes等[3]就鹵蟲在生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。但是，由于學(xué)者們對生態(tài)毒理學(xué)與環(huán)境毒理學(xué)的理解不一致，導(dǎo)致文獻(xiàn)中所論述的部分研究內(nèi)容缺乏明確的生態(tài)毒理學(xué)意義。2006年，孟紫強(qiáng)[19]提出7條標(biāo)準(zhǔn)以區(qū)分環(huán)境毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)，為研究人員提供了參考。他主要從研究對象的不同、研究目的的差異、實(shí)驗(yàn)動物種類及來源、研究結(jié)果是否最終涉及對人類的影響等方面闡述了兩者差異。自這7條標(biāo)準(zhǔn)提出至今，生態(tài)毒理學(xué)又已經(jīng)過了十幾年的發(fā)展。在此期間，隨著實(shí)驗(yàn)方法與檢測技術(shù)的不斷完善與進(jìn)步，鹵蟲在生態(tài)毒理學(xué)中的研究又有一些新的內(nèi)容和成果。鑒于上述情況，本文依托Web of Science、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，通過文獻(xiàn)精準(zhǔn)檢索、深入閱讀，從鹵蟲在毒理學(xué)中的研究入手，分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初衷與目的，篩選出涉及生態(tài)效應(yīng)的相關(guān)文獻(xiàn)，將涉及鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)研究的相關(guān)文章歸納總結(jié)。從物種特征、優(yōu)缺點(diǎn)與應(yīng)用；孵化飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制；實(shí)驗(yàn)類型與暴露方式；主要關(guān)注指標(biāo)與研究目的；存在問題與展望5個方面展開論述，為相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者和研究人員快速了解該研究方向提供參考。

1 鹵蟲屬的生物學(xué)特征、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用(Species characteristics of Artemia, its advantages and limitations in experiments and testing areas)

鹵蟲屬(Artemia)為甲殼動物亞門(Crustacea)、鰓足綱(Branchiopoda)、無甲目(Anostaca)、鹵蟲科(Artemidae: Branchinectidae)唯一的屬。因此，該屬生物統(tǒng)稱為鹵蟲。其發(fā)育過程包括：卵、無節(jié)幼蟲、后無節(jié)幼蟲、擬成蟲和成蟲5個階段。卵在適宜溫度、鹽度下，大約18～30 h孵化為無節(jié)幼蟲，無節(jié)幼蟲到性成熟一般需要8 d。鹵蟲這一特點(diǎn)使其成為實(shí)驗(yàn)室條件下研究多世代遺傳毒性效應(yīng)的理想物種[20]。成蟲體長0.7～1.5 cm，體節(jié)分明，分為頭、胸和腹3個部分[15]。鹵蟲具有2種生殖類型：孤雌生殖和兩性生殖。不同生殖類型主要由種的特性決定[21]，Sukumaran和Grant[20]研究了不同生殖類型的2種鹵蟲(有性生殖種Artemiafranciscana和孤雌生殖種Artemiaparthenogenetica)，對化學(xué)誘變劑的毒性效應(yīng)及其子代在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測中的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孤雌生殖種Artemiaparthenogenetica子代在化學(xué)誘變劑影響下出現(xiàn)DNA損傷的概率更大，該物種更適合生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。鹵蟲具有2種生殖方式，卵胎生和卵生。其中，卵生方式又有2種卵產(chǎn)生，非滯育卵和滯育卵[21]。滯育卵可長期保存，這對該物種適應(yīng)惡劣條件，保持物種延續(xù)具有重要意義。目前，很多學(xué)者以滯育卵為實(shí)驗(yàn)材料研究環(huán)境中化合物對孵化率的影響，從而預(yù)測環(huán)境中化合物對鹵蟲種群可能產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。例如：Migliore等[22]研究了多種抗生素對鹵蟲孵化率的影響，并評估了集約化養(yǎng)殖中使用抗生素可能造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)；Arulvasu等[23]研究了納米銀對鹵蟲孵化率的影響，驗(yàn)證了納米銀在mmol·L-1濃度水平下即可對鹵蟲孵化率產(chǎn)生影響；Sheppard等[24]模擬原油泄露后水體中生物降解過程，并以鹵蟲孵化率作為評估指標(biāo)之一對水體的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估。

初孵化的無節(jié)幼蟲自身貯存一定量的卵黃，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，是很好的生物餌料[15]，同時(shí)也是研究食物鏈傳遞中重要的被捕食生物。利用該特點(diǎn)開展的研究很多。Perez和Wallace[25]研究了不同濃度污染物暴露下草蝦對鹵蟲的捕食成功率。也有學(xué)者研究受污染的鹵蟲被捕食者進(jìn)食后的毒性效應(yīng)[26-27]。Xu和Wang[28]對比魚類在不同暴露條件(水相與食物相)下對重金屬的攝入率，他們以示蹤性同位素109Cd、75Se和65Zn標(biāo)記鹵蟲后投喂給紅鯛魚(Lutjanusargentimaculatus)，以此作為食物相暴露途徑。Ajuzie[29]以進(jìn)食利馬原甲藻(Prorocentrumlima)后的鹵蟲為餌料投喂鱸魚(Dicentrarchuslabrax)幼魚，觀察鱸魚的行為變化。鹵蟲為典型的濾食性動物，可攝食1～50 μm的顆粒物，對5～16 μm的顆粒攝入率更高[21]，張穎等[30]曾研究鹵蟲對湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、杜氏鹽生藻(Dunaliellasalina)和青島大扁藻(Platymonashelgolondica)的攝食率，發(fā)現(xiàn)鹵蟲對粒徑最小的等鞭金藻(藻體長度4.4～7.1 μm)攝食率最高。鹵蟲這一特點(diǎn)有利于研究水體中細(xì)顆粒物的生態(tài)毒性，如納米材料的生態(tài)毒性。目前，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道納米材料(納米銀[31]、納米氧化銅[32]、納米二氧化鈦[33-34]和納米級微塑料[35]等)對鹵蟲的生態(tài)毒性。鹵蟲具有廣食性，除自然界中的細(xì)菌、微藻和小型原生動物外，其食物還包括人工生產(chǎn)的麥麩、豆粕、米糠和乳清粉等[21]。該特點(diǎn)除了利于鹵蟲適應(yīng)多變環(huán)境外也利于其實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，這也是鹵蟲被大量用于實(shí)驗(yàn)室研究的原因之一。

鹵蟲具有廣泛的地理分布，除南極洲外，全球多數(shù)地區(qū)的鹽田或鹽湖均有分布。鹵蟲對極端條件具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，可以在其他生命形式不能生存的環(huán)境下存活[36]。由于其較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，有學(xué)者認(rèn)為鹵蟲對一些環(huán)境化合物的敏感性較其他甲殼綱動物低，并就此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Davoren和Fogarty[37]測試分析了代表水生生態(tài)系統(tǒng)3個營養(yǎng)級的7種生物在特定環(huán)境下的敏感性，結(jié)果表明，7種生物中鹵蟲的敏感性低于其中5種生物。Sanchez-Fortun和Barahona[38]對比了淡水與河口附近的4種小型浮游動物對菊酯類殺蟲劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)鹵蟲的敏感性低于其他3種生物。Watson等[39]研究廢水中的含氯消毒劑副產(chǎn)物對一系列生物的毒性效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)中所有采樣點(diǎn)的含氯消毒劑副產(chǎn)物對鹵蟲無節(jié)幼蟲均未產(chǎn)生明顯的致死效應(yīng)，但對其孵化率產(chǎn)生影響。Zaleska-Radziwill等[40]、李娟英等[41]也曾獲得類似的結(jié)果。Schultz等[42]利用鹵蟲耐受性強(qiáng)的特點(diǎn)，對鹵蟲進(jìn)行毒物包封，然后投喂魚類，研究毒物在食物鏈中的傳遞。雖然，鹵蟲對部分化合物敏感性差，但是研究鹵蟲的生態(tài)毒性對反映其生境或所處生態(tài)位的影響意義明顯。而且有學(xué)者認(rèn)為鹵蟲是生態(tài)毒理學(xué)研究的代表性浮游動物[43-44]。

除上述研究外，關(guān)于鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用還有很多，主要集中在以下幾個方面：(1)有機(jī)污染物的生態(tài)毒性研究，目前，使用鹵蟲研究其生態(tài)毒性的有機(jī)污染物包括各類殺蟲劑[38,45]、抗生素和藥物[40,46]、防污劑[47]等；(2)納米材料的毒性研究，其中，研究最多的是納米級金屬氧化物的生態(tài)毒性[31,48-49]，也有學(xué)者研究石墨烯納米顆粒[50]、納米級微塑料[51]的生態(tài)毒性；(3)污染物治理后的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估，Watson等[39]以鹵蟲為研究對象，評估污水處理廠中氯化消毒后廢水的生態(tài)毒性，Redshaw等[52]研究生物競爭法治理水華后的水體對水生生物鹵蟲(Artemiasalina)、?？?Aiptasiapallida)的生態(tài)毒性，發(fā)現(xiàn)生物競爭法可以降低有毒藻類對水生生物的毒害；(4)特殊環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估，有學(xué)者利用鹵蟲研究污水處理廠污泥浸出液的生態(tài)毒性[41]，還有學(xué)者利用鹵蟲研究海上鉆井平臺鉆井液的生態(tài)毒性[53]等。

2 孵化飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制(Breeding standards and quality control of experimental designs)

在動物實(shí)驗(yàn)中，為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)有效地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化管理至關(guān)重要。以鹵蟲為實(shí)驗(yàn)生物開展的研究已有很多，隨著實(shí)驗(yàn)設(shè)備與操作技術(shù)的優(yōu)化，對鹵蟲的孵化飼養(yǎng)環(huán)節(jié)已基本建立了一套標(biāo)準(zhǔn)方案。筆者通過文獻(xiàn)閱讀發(fā)現(xiàn)，鹵蟲孵化飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)方面的最詳細(xì)的資料是聯(lián)合國糧農(nóng)組織1996年發(fā)布的鹵蟲孵化培養(yǎng)方法[54]。其中，鹵蟲的孵化條件為：最佳孵化鹽度范圍為5‰～35‰，最佳孵化溫度范圍為25～28 ℃，最佳孵化pH應(yīng)>8，孵化時(shí)溶解氧濃度必須≥2 mg·L-1，最佳孵化溶解氧濃度為5 mg·L-1；如使用非商業(yè)滅菌后的蟲卵進(jìn)行孵化時(shí)，應(yīng)使用次氯酸鹽進(jìn)行消毒，以防止細(xì)菌感染。若進(jìn)行完全滅菌可以用次氯酸鹽對蟲卵進(jìn)行脫殼處理。孵化過程需要24 h持續(xù)關(guān)照，光照強(qiáng)度>2 000 lux，蟲卵濃度為2～5 g·L-1。鹵蟲的養(yǎng)殖條件為：最佳鹽度范圍為32‰～65‰，最常用鹽度為35‰；最佳溫度范圍為19～25 ℃；最佳pH范圍為6.5～8；最佳溶解氧濃度為2.5 mg·L-1，養(yǎng)殖密度為5 000～18 000只·L-1。飼養(yǎng)鹵蟲的主要餌料為微藻、干藻制品、酵母和細(xì)菌以及食品生產(chǎn)下腳料等。在投喂策略方面，以單細(xì)胞藻類為餌料時(shí)，如果沒有關(guān)于攝食率或最佳飼料水平的數(shù)據(jù)，可以嘗試以不同的藻類濃度投喂，通過顯微鏡觀察估計(jì)飼料水平。投喂充足的動物的腸道完全充滿，并排出緊實(shí)的糞便顆粒。喂食不足的動物的腸道是空的或沒有被填滿，通常排出松散的糞便顆粒。以干粉類食物投喂時(shí)，培養(yǎng)第1周時(shí)水體透明度應(yīng)保持在15～20 cm，之后，水體透明度保持在20～25 cm。在控制感染方面，非循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)可采用抗生素殺菌，如土霉素。循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)最佳滅菌方法是提高鹽度，最高可將鹽度提高到50‰～65‰。學(xué)者們在使用不同品種的鹵蟲開展實(shí)驗(yàn)時(shí)，大都基于上述孵化飼養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。如Arulvasu等[23]選擇(30±1) ℃下飼養(yǎng)鹵蟲，而Bartolome和Sanchez-Fortun[55]則選擇在25 ℃、pH 8.6、光照1 000 lux下孵化蟲卵。這與不同品種鹵蟲對環(huán)境的耐受性不同有關(guān)。

在測試分析試驗(yàn)中，除了規(guī)范操作外，質(zhì)量控制也非常重要，它可以將測試分析結(jié)果的誤差控制在允許限度內(nèi)，從而提高實(shí)驗(yàn)的可靠性，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可行性具有重要有意義。在涉及鹵蟲的生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)中，不同類型的實(shí)驗(yàn)存在不同的質(zhì)量控制。如在急性暴露實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者認(rèn)為死亡率<0.2為無毒性效應(yīng)[56]，有學(xué)者以10 s不移動作為個體死亡的標(biāo)志[55]，在慢性暴露(14 d)的實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者認(rèn)為對照組的平均死亡率<20%則實(shí)驗(yàn)有效[57]。也有學(xué)者并未設(shè)置質(zhì)量控制程序[33,58]。

3 實(shí)驗(yàn)類型與暴露方式(Types of experimental designs and the style of Artemia’s exposure to toxic pollutants)

毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常見的毒性作用類型是急性毒性作用和慢性毒性作用，特別是與小型無脊椎動物相關(guān)的生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)。通常研究人員根據(jù)研究目的選擇毒性作用類型，如研究水華爆發(fā)后藻類的毒性時(shí)，通常研究藻毒素的急性毒性[59-60]，而研究一些環(huán)境化合物對物種生活史、繁殖策略和遺傳毒性時(shí)選擇研究化合物的慢性或長期毒性作用[20]。文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，在以鹵蟲為研究對象的生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)中，研究化合物對鹵蟲的急性毒性作用的文獻(xiàn)數(shù)量明顯多于慢性毒性作用的，這可能與化合物在水體中的穩(wěn)定性、鹵蟲的生命周期以及急性毒性實(shí)驗(yàn)的可操作性等有關(guān)。鹵蟲的急性毒性試驗(yàn)中，一般的暴露時(shí)間為24 h和48 h。有學(xué)者將鹵蟲的無節(jié)幼體暴露于4種有機(jī)磷農(nóng)藥中，濃度為半數(shù)致死濃度(LC50)，觀察暴露24 h后鹵蟲的運(yùn)動行為(游泳速度)、形態(tài)差異和乙酰膽堿酯酶活性變化[61]。Toussaint等[62]在LC50下將鹵蟲暴露24 h，比較鹵蟲與其他浮游動物對11種化合物急性毒性的敏感性。Sabour等[63]將鹵蟲暴露于含藻毒素的水體中24 h后，以鹵蟲的LC50為標(biāo)準(zhǔn)，分析比較水華中易爆發(fā)的幾種藻類的急性毒性。以鹵蟲為研究對象的急性毒性試驗(yàn)主要包括急性制動實(shí)驗(yàn)、死亡率實(shí)驗(yàn)、行為變化實(shí)驗(yàn)和彗星實(shí)驗(yàn)等。急性制動實(shí)驗(yàn)是計(jì)算鹵蟲在毒物暴露24 h和48 h后靜止不動的鹵蟲的數(shù)量[64]。死亡率實(shí)驗(yàn)通常是計(jì)算同一濃度毒物暴露24、48、72和96 h后鹵蟲的死亡率，以及不同濃度暴露24 h和48 h后群體中10%、20%和50%個體死亡(LC10、LC20和LC50)的致死濃度[33]。行為變化實(shí)驗(yàn)主要是研究鹵蟲在毒物暴露24 h和48 h后，用一個由攝像機(jī)組成的游泳行為記錄儀記錄其游泳過程，主要記錄鹵蟲的游泳速度和路徑[47,65-66]。彗星實(shí)驗(yàn)主要用于分析毒物暴露后生物DNA的受損情況[23]。

除急性毒性試驗(yàn)外，也有部分學(xué)者關(guān)注環(huán)境化合物對鹵蟲的慢性毒性實(shí)驗(yàn)。Bustos-Obregon和Vargas[43]研究鹵蟲暴露于有機(jī)磷酸酯二嗪農(nóng)的慢性毒性效應(yīng)，以確定鹵蟲是否可作為水生環(huán)境污染的指示指標(biāo)。李娟英等[41]研究污水處理廠污泥浸出液對鹵蟲的慢性毒性作用，主要是關(guān)注浸出液對鹵蟲的生長抑制作用。Bergami等[57]對鹵蟲進(jìn)行納米微塑料的長期暴露(14 d)實(shí)驗(yàn)，考察其長期暴露下的死亡率。Schiavo等[49]研究納米氧化鋅對鹵蟲的慢性毒性效應(yīng)與時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅對鹵蟲的毒性效應(yīng)與暴露時(shí)間成正相關(guān)。

毒性效應(yīng)除了與毒物接觸時(shí)間有關(guān)外，與暴露方式也有很大關(guān)系。不同的暴露方式產(chǎn)生的效應(yīng)存在差異，有學(xué)者進(jìn)行了10項(xiàng)不同的試驗(yàn)，對比不同的暴露條件下同一種納米銀懸浮液的毒性，發(fā)現(xiàn)納米材料危害的高質(zhì)量鑒定應(yīng)該基于統(tǒng)一的毒性測試方法及納米材料的特性[67]。鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的暴露方式有很多，根據(jù)化合物種類分為單一毒物暴露和多種毒物暴露。Schiavo等[49]研究了單一毒物氧化鋅納米顆粒對鹵蟲的生態(tài)毒性。Sanchez等[68]研究了西班牙南部砷污染(NaAsO2)與鹵蟲生物入侵的關(guān)系。Rotini等[32]研究了氧化銅納米顆粒對鹵蟲等幾種海洋模式生物的生態(tài)毒性。類似研究還有很多，但是，在實(shí)驗(yàn)室以外的環(huán)境中單一污染物單獨(dú)存在的可能性較小，所以更多的研究涉及多種毒物暴露。多種毒物暴露實(shí)驗(yàn)主要分為：多種毒物分別暴露和混合物暴露。有學(xué)者以鹵蟲為研究對象采用分別暴露的方式研究地表水中抗菌藥物、雌激素和細(xì)胞抑制劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[40]。Minguez等[69]研究了48種藥物分別暴露對鹵蟲的毒性效應(yīng)，并根據(jù)公式計(jì)算出藥物混合物的生態(tài)毒性。當(dāng)2種或多種化合物同時(shí)存在于環(huán)境中時(shí)，研究其生態(tài)毒性必須以混合物暴露為暴露方式，如在農(nóng)田附近水體中除草劑和殺蟲劑往往同時(shí)存在，Van den Brink等[70]研究了殺蟲劑和除草劑混合物對鹵蟲的聯(lián)合毒性，Sabour等[63]研究了水華中藻類有毒成分(通常為多種化合物的混合物)對鹵蟲的生態(tài)毒性。

根據(jù)暴露生物種類劃分，暴露方式分為單一物種暴露和多物種暴露。每一項(xiàng)研究除了考慮研究意義外，其可行性也是一個重要因素。當(dāng)研究的化合物種類很多時(shí)，研究人員通常選擇代表性物種作為實(shí)驗(yàn)對象。Migliore等[22]研究5種藥品進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，只選擇了代表性的鹵蟲作為研究對象。還有學(xué)者以鹵蟲為實(shí)驗(yàn)動物研究了56種殺蟲劑的生態(tài)毒性[71]。另外，在研究特定環(huán)境下水體的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，也會選擇代表性物種作為研究對象。Serrano等[72]研究了高鹽度水中有機(jī)污染物的分布和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，他們通過分析不同采樣點(diǎn)采集的鹵蟲體內(nèi)污染物濃度，揭示了高鹽度水體中的代表性生物面臨的潛在威脅。動物生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的研究對象往往是生態(tài)系統(tǒng)中的種群、群落和生態(tài)系統(tǒng)。所以，在生態(tài)毒理學(xué)的研究中，通常認(rèn)為多物種或不同種群的暴露結(jié)果的生態(tài)學(xué)意義更加明顯。另外，隨著實(shí)驗(yàn)室條件優(yōu)化、模式生物的開發(fā)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的進(jìn)步，越來越多的生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)以多物種暴露為主。目前，在水生生態(tài)毒理學(xué)的研究中大量實(shí)驗(yàn)選擇以生物組系(bioassay battery)或多物種組成的微生態(tài)系統(tǒng)(Microcosm)為研究對象，研究環(huán)境化合物對整個生物組系或微生態(tài)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)，從而更好地反映化合物對不同物種或不同營養(yǎng)級生物的影響，進(jìn)一步推測化合物對生態(tài)系統(tǒng)的影響及化合物在生態(tài)系統(tǒng)中遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。涉及鹵蟲的多物種暴露實(shí)驗(yàn)主要有對比暴露、生物組系暴露。目前，以鹵蟲為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行的對比暴露實(shí)驗(yàn)包括同一物種不同品種間的對比和不同營養(yǎng)級多個物種間的對比。有學(xué)者對比了乙基甲磺酸對于不同繁殖方式的2種鹵蟲的遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)在相同毒物暴露下不同生殖策略的多代遺傳毒性存在差異[20]。還有研究比較了鹵蟲等5種水生生物分別暴露于多種化合物中的敏感性，結(jié)果表明，5個試驗(yàn)物種對大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的中毒濃度排序相似[73]。生物組系暴露是生態(tài)毒理學(xué)中最常用的暴露方式。生物組系暴露為多種暴露試驗(yàn)的組合，其主要實(shí)驗(yàn)類型有發(fā)光細(xì)菌實(shí)驗(yàn)、藻類毒性試驗(yàn)、種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)、浮游動物致死率實(shí)驗(yàn)和幼魚中毒效應(yīng)實(shí)驗(yàn)等[64,74]。其中，浮游動物致死率實(shí)驗(yàn)中，常用物種之一就是鹵蟲。有研究以三角褐指藻的毒性試驗(yàn)和鹵蟲的急性致死實(shí)驗(yàn)為測試組系評估意大利近海鉆井活動產(chǎn)生的鉆井液可能對海洋生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[53]。通常認(rèn)為實(shí)驗(yàn)物種越多越能夠準(zhǔn)確反映化合物對生態(tài)系統(tǒng)的毒性，因此，Davoren和Fogarty[37]、Libralato等[75]和Faimali等[59]多位學(xué)者都選擇了多物種暴露的生物組系暴露方式來評估環(huán)境中某種或某類化合物的生態(tài)毒性。由于不同生物對不同化合物的敏感性不同，生物組系暴露中選擇合適的生物很重要。有學(xué)者評估了幾種浮游動物的毒性測定方法的敏感性，發(fā)現(xiàn)藻類生物測定法比以鹵蟲為實(shí)驗(yàn)動物的無脊椎動物死亡率測定法更敏感[76]。

暴露方式根據(jù)暴露場景分為原位暴露和實(shí)驗(yàn)室暴露。由于環(huán)境要素復(fù)雜多變，原位暴露在生態(tài)毒理學(xué)研究中具有重要意義，原位暴露可以更好地反映化合物對研究區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的影響。Serrano等[72]采集野外原生鹵蟲并利用氣相色譜-高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-TOF MS)檢測其體內(nèi)的多種有機(jī)污染物，分析高鹽水生生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)污染模式，從而預(yù)測采樣區(qū)潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。Napiorkowski等[77]采集原位水體樣品養(yǎng)殖鹵蟲，預(yù)測采樣點(diǎn)水體的生態(tài)毒性。由于原位暴露的不可控因素較多，目前，利用鹵蟲開展的暴露實(shí)驗(yàn)多以實(shí)驗(yàn)室暴露為主。如上文論述的納米材料[31]、殺蟲劑[38,45]、抗生素[40,46]和重金屬[68]等生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)均是在實(shí)驗(yàn)室條件下開展的。

4 主要關(guān)注指標(biāo)與研究目的(Key experimental indicators and research objective)

涉及鹵蟲的毒性試驗(yàn)很多，不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的研究目的不盡相同。通過化合物暴露，研究目的最終關(guān)系到人類健康的研究通常被認(rèn)為是環(huán)境毒理學(xué)的范疇，以化合物對生態(tài)系統(tǒng)中的非人類生物的毒性效應(yīng)為指標(biāo)，進(jìn)而分析化合物對生態(tài)系統(tǒng)的影響的研究通常被認(rèn)為是生態(tài)毒理學(xué)的范疇[19]。在眾多水生生態(tài)毒理學(xué)文獻(xiàn)中，以鹵蟲為實(shí)驗(yàn)動物的研究中最常使用的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)包括卵的孵化率、生長狀況、行為變化和死亡率等。Migliore等[22]以鹵蟲孵化率和死亡率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析了抗生素的生態(tài)毒性。Vismara[78]研究了甲醇、乙醇和正丙醇對鹵蟲孵化率的影響，并得出了不同化合物對鹵蟲的LC50，從而揭示3種化合物在環(huán)境中對鹵蟲生存繁衍的影響。以行為變化為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的研究主要是觀察化合物暴露后鹵蟲游泳行為的變化[65,79]和化合物對鹵蟲趨光性的抑制作用[55]等。除此之外，也有學(xué)者通過組織形態(tài)學(xué)變化來判斷化合物對鹵蟲的毒性效應(yīng)。Kachenton等[80]對納米鈦暴露后的鹵蟲進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)鹵蟲整個腸道阻塞，上皮細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)增生、絨毛變形、排列紊亂、嚴(yán)重水腫和壞死等現(xiàn)象。隨著儀器設(shè)備及試驗(yàn)方法的不斷更新優(yōu)化，無脊椎動物在生態(tài)毒理學(xué)研究中被關(guān)注的指標(biāo)越來越多，分子層面的一些指標(biāo)也開始用于無脊椎動物的生態(tài)毒性研究。Venkateswara Rao等[61]利用彗星實(shí)驗(yàn)研究納米銀顆粒對鹵蟲的DNA損傷，發(fā)現(xiàn)納米銀顆粒濃度與DNA損傷比例呈正相關(guān)關(guān)系[23]。還有學(xué)者關(guān)注了某些酶的活性變化，如乙酰膽堿酯酶，它可以將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿快速水解成膽堿和乙酸鹽，在膽堿能突觸的神經(jīng)傳遞中起著重要作用。Varo等[81]對比有機(jī)磷農(nóng)藥對2種鹵蟲(入侵種與本地種)不同發(fā)育階段乙酰膽堿脂酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)入侵種的敏感性低于本地種。由于三磷酸腺苷(ATP)酶活性變化可以用來衡量化合物的毒性效應(yīng)，因此，有學(xué)者以ATP酶活性作為研究指標(biāo)分析防污涂料對鹵蟲ATP酶活性的影響[82]。

在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置合適的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)可以直接了解化合物的毒性效應(yīng)。但是在生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)除了明確毒性效應(yīng)外，還要明確化合物對生態(tài)系統(tǒng)中生物或生態(tài)系統(tǒng)的影響，以預(yù)測生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)研究目的劃分，鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)中研究大致可以分為3類：(1)直接危害研究，即關(guān)注環(huán)境化合物對生物的直接毒害，此類研究很多，如前文提到的生長抑制實(shí)驗(yàn)[41]、趨光性抑制實(shí)驗(yàn)[55]、組織切片觀察實(shí)驗(yàn)[80]、乙酰膽堿脂酶活性變化實(shí)驗(yàn)[81]和ATP酶活性變化實(shí)驗(yàn)[82]等；(2)間接效應(yīng)研究，間接效應(yīng)主要是通過毒性效應(yīng)對某些技術(shù)或方法進(jìn)行生態(tài)評價(jià)，目前相關(guān)研究主要集中于修復(fù)效果的生態(tài)評價(jià)，其中，利用生物組系暴露實(shí)驗(yàn)評價(jià)某種修復(fù)技術(shù)的修復(fù)效果的研究最多；Edmilson Souza Freitas等[83]以鹵蟲急性毒性試驗(yàn)、植物發(fā)芽率與生長抑制實(shí)驗(yàn)等評估使用鋁鹽和植物凝集素降低水體的濁度和毒性的效果；Ambrosio等[84]研究光芬頓反應(yīng)(Phtoto-Fenton reaction)降解水體中的生物柴油，并利用鹵蟲的致死試驗(yàn)評估水體的修復(fù)效果；(3)潛在風(fēng)險(xiǎn)研究，即關(guān)注化合物的潛在風(fēng)險(xiǎn)，學(xué)者們開展的急性暴露實(shí)驗(yàn)中所關(guān)注的死亡率多以預(yù)測化合物的潛在風(fēng)險(xiǎn)為目的，Koutsaftis和Aoyama[85]利用急性毒性試驗(yàn)研究化合物對鹵蟲的LC20、LC50和LC80值，并基于這3個濃度進(jìn)一步研究溫度和鹽度對鹵蟲死亡率的影響，從而更好地評估化合物的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；Rotini等[32]和Sibila等[58]研究不同濃度梯度暴露對鹵蟲的LC50，其目的也是預(yù)測化合物的潛在毒性效應(yīng)；Niu等[86]利用微囊藻毒素對鹵蟲等水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建物種敏感性分布模型，從而預(yù)測海河上游微囊藻毒素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；還有學(xué)者研究化合物與鹵蟲生物入侵的關(guān)系，Sanchez等[68]從急性致死率實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測出砷污染抑制了鹵蟲在西班牙南部的生物入侵現(xiàn)象。

5 存在問題與展望(Existing limitations and future prospects)

鹵蟲生命周期短且分布廣泛，其滯育卵可長期保存并在適宜條件下具有高孵化率，因此，鹵蟲在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中得到較好的應(yīng)用。但是，就目前的研究進(jìn)展而言，還存在一些問題。由于其種間差異、繁殖方式差異和原生生境差異等，目前缺乏統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)將鹵蟲在生態(tài)毒理學(xué)的應(yīng)用推廣到更廣泛的領(lǐng)域。例如，Kos等[31]提出，目前還沒有統(tǒng)一的檢測方案可以就不同化合物危害鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。他們通過比較不同實(shí)驗(yàn)室間鹵蟲暴露于納米銀顆粒后的毒性效應(yīng)找到了化合物危害鑒定結(jié)果無法統(tǒng)一的部分原因，包括孵化條件和納米材料的形態(tài)等。也有學(xué)者嘗試?yán)名u蟲建立生物富集模型，他們利用線性回歸模型和分段回歸模型計(jì)算，發(fā)現(xiàn)水體和鹵蟲組織中硒濃度之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，但當(dāng)水體中硒濃度<10 mg·L-1，模型的預(yù)測能力非常弱[87]。

新孵化的鹵蟲幼蟲被認(rèn)為是多種實(shí)驗(yàn)研究的優(yōu)良餌料[88-89]，有研究人員利用生物強(qiáng)化技術(shù)為養(yǎng)殖業(yè)的疾病治療和營養(yǎng)物質(zhì)強(qiáng)化提供支持[90-91]。在生態(tài)毒理學(xué)研究中，也有學(xué)者利用化合物浸染后的鹵蟲投喂捕食者，研究化合物在食物鏈中的傳遞[26-27]。但是，在同一環(huán)境下捕食者與被捕食者往往同時(shí)受到毒物威脅，之前的研究大多只關(guān)注捕食者進(jìn)食后的毒性效應(yīng)，忽略了污染物對被捕食者的毒害作用及其對污染物的代謝。因此，要準(zhǔn)確評估化合物的生態(tài)毒性應(yīng)該采用多營養(yǎng)級生物同時(shí)暴露的方法，并且深入分析不同營養(yǎng)級生物對化合物的代謝過程。

利用鹵蟲進(jìn)行的毒性實(shí)驗(yàn)中最多的是急性毒性實(shí)驗(yàn)，多數(shù)急性暴露不以環(huán)境濃度為依據(jù)[56,58,73]，但是要更好地了解化合物對環(huán)境中生物的毒性效應(yīng)，必須基于環(huán)境濃度開展研究，同時(shí)，結(jié)合環(huán)境要素研究化合物的長期毒性效應(yīng)和遺傳毒性，從而對化合物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行全面的預(yù)測。另外，目前開展的實(shí)驗(yàn)多以實(shí)驗(yàn)室模擬為主，而自然環(huán)境復(fù)雜多變，原位暴露實(shí)驗(yàn)的生態(tài)學(xué)意義更明顯。為了精準(zhǔn)模擬環(huán)境要素或環(huán)境化合物對自然環(huán)境中生物的影響，今后在鹵蟲的生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)加強(qiáng)不同生態(tài)位物種組合實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮環(huán)境因素與化合物對鹵蟲的聯(lián)合效應(yīng)。多物種組合暴露是當(dāng)前生態(tài)毒理學(xué)研究的主要趨勢，但是，生物組系中不同生物測試方法的敏感性存在差異，合理選擇生物測試方法有利于準(zhǔn)確了解化合物的生態(tài)毒性。在生態(tài)毒性暴露實(shí)驗(yàn)中，除生物組系暴露外，還有研究人員采用微生態(tài)系統(tǒng)暴露實(shí)驗(yàn)分析化合物對復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)及生物多樣性的影響。微生態(tài)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)是以多種生物共同組成的微生態(tài)系統(tǒng)為研究基礎(chǔ)，研究環(huán)境化合物對系統(tǒng)內(nèi)生物生理活動的影響[92]。其優(yōu)點(diǎn)是可以盡量還原自然環(huán)境中的生態(tài)毒性效應(yīng)和規(guī)律。之前有學(xué)者認(rèn)為，大型水蚤是許多無脊椎動物中最敏感的一種，輪蟲最不敏感[93]。所以，目前的微生態(tài)系統(tǒng)研究中的浮游動物通常選擇這2種生物，選擇鹵蟲作為微生態(tài)系統(tǒng)組分進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究的文獻(xiàn)很少。筆者認(rèn)為，在研究以鹵蟲為代表性物種的水環(huán)境時(shí)，可以建立由鹵蟲和其他生物組成的微生態(tài)系統(tǒng)開展研究。

目前，大部分研究關(guān)注毒性效應(yīng)及其所反映的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，而就生物體而言，其中毒機(jī)制的研究有待深入。Nikinmaa和Rytkonen[94]在論述功能基因組學(xué)在水生毒理學(xué)中的應(yīng)用時(shí)，提出的“功能基因組研究對解決當(dāng)前環(huán)境問題具有重要意義”。關(guān)于鹵蟲在生態(tài)毒理學(xué)中的研究也應(yīng)該從基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等研究方向出發(fā)，挖掘其耐受性及毒性效應(yīng)相關(guān)基因、蛋白和酶等，從而明確鹵蟲對外界干擾的調(diào)控機(jī)制。另外，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們已經(jīng)開始從事化合物對鹵蟲腸道微生物的干擾研究[95]，雖然，該研究方法尚未出現(xiàn)在鹵蟲相關(guān)的水生生態(tài)毒理學(xué)研究中，但未來可以將腸道微生物變化作為鹵蟲在水生生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)中的一個指標(biāo)。

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