劉立盤,鐘永達(dá),楊愛紅,陳彩慧,李彥強(qiáng),余發(fā)新

(江西省科學(xué)院生物資源研究所江西省觀賞植物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)江西南昌330096)

端粒是位于線性真核生物染色體末端的特殊染色質(zhì)結(jié)構(gòu),是由重復(fù)DNA序列和蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜核蛋白結(jié)構(gòu)[1]。端粒相關(guān)蛋白質(zhì)可以通過調(diào)控端粒酶的通路或調(diào)節(jié)DNA復(fù)制機(jī)制來控制端粒長(zhǎng)度。端粒DNA分為雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)和單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA),與蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合形成端粒蛋白復(fù)合體(shelterin),該復(fù)合體主要由TRF1/2(telomeric repeat binding factor 1/2)、POT1(protection of telomeres 1)、TIN2(TRF1-interacting nuclear protein 2)、RAP1(repressor activator protein 1)以及 TPP1(telomere binding protein POT1-interacting protein 1)構(gòu)成[2]。TRF1、TRF2和特異性端粒dsDNA的連接通過Myb(v-myb avian myeloblastosis viral onco-gene homolog)結(jié)構(gòu)域的LKDKWRT氨基酸基序介導(dǎo)[3]。DNA-TRF1、TRF2和ssDNA結(jié)合蛋白POT1之間的連接通過TIN2和TPP1蛋白的寡糖/寡核苷酸介導(dǎo)[4]。RAP1蛋白是端粒蛋白復(fù)合體的最后一個(gè)組成部分,它與TRF2相互作用,并控制端粒DNA長(zhǎng)度[5]。

二十多年前,Riha等[6]報(bào)道了一種基于Southern blotting技術(shù)測(cè)量端粒長(zhǎng)度的末端限制性片段(terminal restriction fragment,TRF)方法。此后,其他測(cè)量端粒長(zhǎng)度的方法相繼被報(bào)道,包括定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative PCR,qPCR)、定量熒光原位雜交(quantitative fluorescence in situ hybridization,Q-FISH)、流式-熒光原位雜交(flow cytometry-fluorescence in situ hybridization,Flow-FISH)及單鏈端粒長(zhǎng)度分析(single telomere length analysis,STELA)[7～8]。其中,TRF 方法可提供端粒的絕對(duì)長(zhǎng)度和異質(zhì)性數(shù)據(jù),仍然被認(rèn)為是測(cè)量端粒長(zhǎng)度的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。端粒酶活性的檢測(cè)有直接和間接兩種方法,直接檢測(cè)方法包括:端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplication protocol,TRAP)、TRAP-銀染法、TRAP-酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)和雜交鏈?zhǔn)叫盘?hào)放大反應(yīng)結(jié)合磁分離技術(shù)法；間接檢測(cè)方法包括:亞甲藍(lán)(methylene blue,MB)作為G-四聯(lián)體結(jié)合探針法、石墨烯雜化比色法和依賴無標(biāo)記分子信標(biāo)的級(jí)聯(lián)放大DNA機(jī)制法。其中,TRAP法比較靈敏、迅速且重復(fù)性好,應(yīng)用最廣[10]。本文將對(duì)端粒、端粒酶及其相關(guān)基因在植物中的調(diào)控研究進(jìn)展進(jìn)行闡述,為端粒的進(jìn)一步研究提供參考。

1 端粒的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

端粒具有重要的生物學(xué)功能,它可以防止染色體的降解和融合,以及DNA復(fù)制過程中末端序列的丟失[11～12]。幾乎所有高等植物的端粒都是由七核苷酸擬南芥(Arabidopsis thaliana)端粒重復(fù)序列(TTTAGGG)n組成[13～14]。但是天門冬目(Asparagales)中的幾個(gè)單子葉植物含有6個(gè)人類端粒重復(fù)序列(TTAGGG)n[14]。近期研究顯示,植物中的端粒序列存在多樣性。Tran等[15]報(bào)道,螺旋貍藻屬(Genlisea)的一些物種存在兩種混合變異序列(TTCAGG和TTCAGG),這種變異是由種內(nèi)進(jìn)化產(chǎn)生的。此外,人們?cè)诿o夜香樹(Cestrum elegans)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特異的端粒序列(TTTTTTAGGG)[16]。Fajkus等[17]發(fā)現(xiàn)在蔥屬(Allium spp.)中也存在一個(gè)獨(dú)特的端粒序列(CTCGGTTATGGG)。在整個(gè)植物家族,除了陸地植物,還包括紅藻(Rhodophyta)、綠藻(Chlorophyta)和灰藻(Glaucophytes)等藻類及其他低等生物,它們都存在著不同的端粒重復(fù)序列類型。

1988年,端粒序列在擬南芥中首次成功克隆[18]。受遺傳和發(fā)育兩方面的控制,端粒長(zhǎng)度會(huì)在一定范圍內(nèi)變化。目前在植物中發(fā)現(xiàn),端粒DNA在小立碗蘚(Physcomitrella patens)中的最短長(zhǎng)度可至500 bp[19],在煙草(Nicotiana tabacum)中的長(zhǎng)度可為160 kb[20],而且在美花煙草(Nicotiana sylvestris)中的長(zhǎng)度可達(dá)200 kb[21]。植物端粒長(zhǎng)度在不同屬或種之間存在顯著差異,在物種發(fā)育或生態(tài)型水平上也存在差異,例如:擬南芥的端粒長(zhǎng)度根據(jù)不同的生態(tài)型從2 kb到9 kb不等[22]；在灰葉劍麻(Agave fourcroydes Lem)和韋伯龍舌蘭(A-gave tequilana Weber)莖段組織培養(yǎng)過程中,端粒長(zhǎng)度的變化范圍分別為22.8～50.8 kb和27.8～37.8 kb[23]。另外,在長(zhǎng)壽樹種歐洲白樺(Betula pendula Roth)中,不同基因型的端粒長(zhǎng)度最短變化范圍為 5.9～9.6 kb,最長(zhǎng)變化范圍為 15.3～22.8 kb[24]。

2 端粒酶的結(jié)構(gòu)

端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶,對(duì)端粒的延長(zhǎng)和維持起著重要的催化作用[25]。端粒酶能以自身的RNA亞基作為模版,在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)的作用下在端粒的3′端添加串聯(lián)的七核苷酸重復(fù)序列以保持染色體的穩(wěn)定性[26]。

端粒酶由線性染色體3′末端的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)組成[27],具有端粒酶RNA(telomerase RNA,TER)和TERT兩個(gè)核心亞基。TER由1個(gè)單一的長(zhǎng)鏈非編碼RNA序列組成。TERT亞基在進(jìn)化中形成了保守的一級(jí)結(jié)構(gòu),在大多數(shù)生物體中可進(jìn)一步分為N-末端域(telomerase essential N-terminal,TEN)、TR結(jié)合域(TR binding domain,TRBD)、中心逆轉(zhuǎn)錄酶域(reverse transcriptase,RT)和C-末端延長(zhǎng)域(C-terminal extension,CTE)[28～29]。端粒酶在各個(gè)亞單位的協(xié)作下精確調(diào)控端粒的延長(zhǎng)和縮短過程。從分子水平看,端粒長(zhǎng)度的保持主要通過端粒酶修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)[30]。端粒酶能夠延長(zhǎng)端粒序列和拉長(zhǎng)染色體末端端粒長(zhǎng)度,可以補(bǔ)償端粒在染色體復(fù)制過程中所產(chǎn)生的持續(xù)性丟失,起著維護(hù)染色體穩(wěn)定性的作用[2,31]。

3 植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的變化

在林木中,端粒及端粒酶對(duì)銀杏(Ginkgo biloba L.)發(fā)育和衰老的調(diào)控研究報(bào)道較多。Liu等[32]指出銀杏葉片隨著樹齡的增加,其端粒長(zhǎng)度增加趨勢(shì)明顯,而且不同銀杏組織端粒長(zhǎng)度的順序?yàn)?小樹枝＞葉片＞胚愈傷組織＞小孢子。該研究還建立了端粒長(zhǎng)度與樹齡相關(guān)性的理論模型,結(jié)果表明長(zhǎng)壽銀杏的端粒長(zhǎng)度可以在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間有效地保持?jǐn)?shù)千年。另有研究報(bào)道,從胚到幼苗的不同發(fā)育階段,銀杏的端粒長(zhǎng)度呈現(xiàn)周期性變化[33]。相關(guān)研究顯示,銀杏4個(gè)樹齡(10、20、70±10和700±100)的端粒長(zhǎng)度從4月到8月沒有明顯變化(P＞0.05),但從9月到10月顯著下降(P＜0.05)[34],說明銀杏端粒長(zhǎng)度的變化與季節(jié)相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)銀杏的端粒酶展開研究發(fā)現(xiàn),隨著樹齡(10～700年)的增加,葉片端粒酶活性呈下降的趨勢(shì)[35～36]；銀杏不同組織(胚性愈傷組織、小孢子和葉片)的端粒酶活性存在差異,其中胚性愈傷組織的端粒酶活性最高；在全年生長(zhǎng)周期中,端粒酶活性在4月最高,表明銀杏的端粒酶活性也具有季節(jié)性變化[36]。此外,研究人員在刺果松(Pinus longaeva)中也發(fā)現(xiàn)了端粒長(zhǎng)度與樹齡的相關(guān)性。研究顯示,2 000～5 000年樹齡的刺果松根系的端粒長(zhǎng)度比400～500年和100～200年的都要長(zhǎng),表明端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性與刺果松樹齡有著直接或間接的關(guān)系[26]。近年來,其他樹種的端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性與季節(jié)變化的關(guān)系也有報(bào)道。例如:油松 (Pinus tabulaeformis Carr.)端粒長(zhǎng)度的變化與月平均溫度的變化趨勢(shì)相似(正相關(guān)),而端粒酶活性的變化與月平均溫度的變化趨勢(shì)相反(負(fù)相關(guān)),因此,油松的端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性隨季節(jié)性變化而變化[37]；青梣(Fraxi-nus pennsylvanica Mars.var.subintegerrima[Vahl.]Fern.)和旱柳(Salix matsudana Koidz.)的端粒長(zhǎng)度、端粒酶活性也與季節(jié)的變化相關(guān),但端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的變化沒有相關(guān)性[38]。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中,端粒的伸長(zhǎng)和縮短與細(xì)胞復(fù)制、分化及再生有關(guān)。研究人員對(duì)0～200年樹齡的歐洲赤松(Pinus sylvestris L.)的不同組織(未成熟的胚胎、形成層、芽和成熟樹木的針葉)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度隨著組織分化程度的增加而縮短,其中未成熟胚胎的端粒長(zhǎng)度最長(zhǎng)；同時(shí),該研究發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度與組織的位置相關(guān),在老樹(50～200歲)中,莖形成層的端粒長(zhǎng)度隨高度的增加而縮短[39]。另外,不同樹齡、同一植物不同組織以及不同分化程度的相同組織的端粒長(zhǎng)度都可能存在差異[40]。相關(guān)研究指出2～8年人參(Panax ginseng C.A.Meyer)主根的端粒長(zhǎng)度與年齡呈正相關(guān)關(guān)系[41]。一項(xiàng)早期研究表明,大麥(Hordeum vulgare L.)的端粒長(zhǎng)度在整個(gè)植株發(fā)育過程中逐漸變短,成年葉片的端粒長(zhǎng)度由幼胚中的80 kb縮減到30 kb,但在愈傷組織培養(yǎng)過程中變長(zhǎng)[42]。與此類似,Rescalvo-Morales等[23]研究發(fā)現(xiàn)灰葉劍麻和韋伯龍舌蘭兩個(gè)品種的莖段組織在體外誘導(dǎo)生長(zhǎng)(0～8個(gè)星期)時(shí),其端粒長(zhǎng)度呈逐漸伸長(zhǎng)的趨勢(shì)。

近年來,擬南芥及農(nóng)作物的端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性研究相繼被報(bào)道。擬南芥不同組織在不同發(fā)育階段的端粒長(zhǎng)度無明顯變化,說明端粒長(zhǎng)度不參與擬南芥衰老過程中的細(xì)胞分化和復(fù)制,也不參與有絲分裂[43]。在番茄(Solanum lycopersicum)植株4周至6個(gè)月的衰老過程中,研究者未觀察到葉片端粒長(zhǎng)度的變化[44]。女婁菜(Melandrium album)不同組織和發(fā)育階段的端粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定,端粒酶活性在萌發(fā)的幼苗和根尖中最高,而在葉片中下降了99%；在休眠的種子中沒有檢測(cè)到端粒酶活性,而在成熟的花粉粒中檢測(cè)到了端粒酶活性[6]。煙草葉片愈傷組織在脫分化和再分化過程中其端粒長(zhǎng)度沒有顯著變化,但明顯高于葉片外植體[45]。在大麥中,胚、花藥和心皮組織的端粒酶活性較高,但是端粒酶的活性在胚胎發(fā)育過程中逐漸下降[46～47]。另外,在大豆(Glycine max)、菜花(Brassica oleracea)和胡蘿卜(Daucus carota)的懸浮培養(yǎng)組織中端粒酶活性較高,但在成熟的分化組織中端粒酶活性較低[48],表明端粒酶活性在分化能力強(qiáng)的細(xì)胞和組織中較高。

4 端粒長(zhǎng)度及端粒酶相關(guān)基因的研究

端粒酶具有維持端粒穩(wěn)定性的功能,對(duì)端粒長(zhǎng)度的調(diào)控具有重要的作用。在基因調(diào)控中,TERT參與了端粒DNA合成、維持端粒長(zhǎng)度及賦予細(xì)胞無限增殖能力等途徑。煙草TERT基因的變異序列TERT_Ct和TERT_Cs在幼苗、根、花芽及葉片中均高水平表達(dá),而TERT_D的表達(dá)水平則較低[49]。擬南芥端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(AtTERT)編碼的蛋白質(zhì)含有保守的逆轉(zhuǎn)錄酶和端粒酶特異性基序,研究報(bào)道,該基因在擬南芥愈傷組織中高表達(dá),在缺乏AtTERT基因的情況下,每一代端粒長(zhǎng)度會(huì)縮短500 bp[50]。另外,擬南芥AtTERT基因的TDNA突變體會(huì)導(dǎo)致每代端粒DNA逐漸縮短250～500 bp,在第5代以后,植物發(fā)生器官和分生組織開始畸形,最終停止生長(zhǎng)[51]。這意味著端粒酶基因?qū)χ参锏陌l(fā)育是必不可少的。從沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)克隆到的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(AmTERT)在根和葉中表達(dá)較高,同時(shí)鹽、干旱、熱及低溫脅迫均能導(dǎo)致沙冬青幼苗根和葉中Am-TERT的表達(dá)量升高,說明AmTERT基因具有應(yīng)激保護(hù)功能[52]。

端粒結(jié)合蛋白(telomere binding protein,TBP)可以通過結(jié)合到端粒上阻礙端粒酶發(fā)揮調(diào)控端粒長(zhǎng)度的功能。擬南芥端粒結(jié)合蛋白基因(AtTBP1)可以與植物端粒重復(fù)序列TTTAGGG特異性結(jié)合,研究顯示其在基因組中以單拷貝形式存在,并在各個(gè)組織中均有表達(dá),推測(cè)可能在端粒功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用[53]。相關(guān)研究報(bào)道,水稻端粒結(jié)合蛋白基因(RTBP1)負(fù)調(diào)控端粒長(zhǎng)度,敲除RTBP1后,水稻突變體的端粒長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于野生型,但4代以后植株的生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重干擾,細(xì)胞分裂后期染色體融合頻率增加[54]。

Ku80基因在最近的研究報(bào)道中都涉及到端粒長(zhǎng)度的調(diào)控。在擬南芥和大麥中,Ku80基因具有調(diào)控端粒長(zhǎng)度的功能,AtKu80和HvKu80突變體的端粒長(zhǎng)度相對(duì)于野生型植株都顯著伸長(zhǎng)[55～56]。在水稻中,RNAi介導(dǎo)的基因敲除植株(Ubi:RNAi-OsKu80)與野生型水稻相比,在萌發(fā)后期表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩及端粒長(zhǎng)度明顯增加,說明OsKu80在水稻植株的生長(zhǎng)發(fā)育和端粒長(zhǎng)度調(diào)控中發(fā)揮重要作用[57]。DNA甲基化(DNA methylation)在調(diào)控端粒基因表達(dá)中也發(fā)揮著重要的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)擬南芥缺乏DDM1(deficient in DNA methylation 1)后在G1～G5代可以實(shí)現(xiàn)自我繁殖,同時(shí)端粒長(zhǎng)度保持穩(wěn)定,但在第6代(G6)開始出現(xiàn)不育,端粒長(zhǎng)度急劇縮短[58]。

端粒及端粒酶在眾多基因調(diào)控下共同參與和控制植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。把水稻中的OsTRFL1(Oryza sativa TRF like 1)基因敲除后,突變體的端粒長(zhǎng)度相對(duì)于野生型的5～12 kb伸長(zhǎng)到6～25 kb,說明OsTRFL1負(fù)調(diào)控端粒長(zhǎng)度；同時(shí),該研究發(fā)現(xiàn)OsTRFL1基因表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致水稻營(yíng)養(yǎng)和生殖器官發(fā)育嚴(yán)重不足[59]。苔蘚植物小立碗蘚原絲體在培養(yǎng)過程中的端粒長(zhǎng)度比較穩(wěn)定,而相對(duì)端粒酶活性則在培養(yǎng)1～3 d時(shí)呈急劇下降的趨勢(shì)。另外,與野生型相比,mre11、rad50、nbs1、ku70和lig4突變體的端粒長(zhǎng)度都有改變,說明這5個(gè)基因都參與了端粒長(zhǎng)度的調(diào)控[19]。

5 端粒在植物衰老過程中的作用

衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育中出現(xiàn)的不可逆的生長(zhǎng)和停滯現(xiàn)象,是生物體DNA、蛋白質(zhì)和其他大分子隨機(jī)損傷不斷累積的過程[60]。衰老最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,其特征是細(xì)胞增殖不可逆,基因表達(dá)模式改變,細(xì)胞凋亡抗性增加,特異性細(xì)胞功能改變,并伴隨端?？s短[26]。

端粒的變短導(dǎo)致DNA損傷信號(hào)啟動(dòng),從而引起細(xì)胞衰老[61]。染色體由于末端復(fù)制導(dǎo)致端粒在每一輪細(xì)胞復(fù)制中會(huì)相應(yīng)縮短,而端粒長(zhǎng)度縮短會(huì)觸發(fā)細(xì)胞衰老[62],進(jìn)而會(huì)引起氧化性損傷、基因的過度表達(dá)、染色質(zhì)改變和DNA損傷等應(yīng)激反應(yīng)[25]。端?？梢宰鳛橐粋€(gè)“生物時(shí)鐘”反映細(xì)胞的分裂次數(shù),決定細(xì)胞衰老和死亡發(fā)生的時(shí)間[25]。因此,端粒被認(rèn)為是衰老的生物標(biāo)記之一。

染色體DNA在復(fù)制過程中往往伴隨著端粒磨損,異常的端粒結(jié)構(gòu)將進(jìn)一步提高端粒磨損發(fā)生的速率,進(jìn)而導(dǎo)致端粒的穩(wěn)定性降低。細(xì)胞內(nèi)的端粒融合和雙著絲粒染色體結(jié)構(gòu)會(huì)誘導(dǎo)異常表型的形成,并觸發(fā)細(xì)胞衰老甚至凋亡的發(fā)生[63]。當(dāng)然,衰老不僅僅是端粒磨損,它的發(fā)生也是受基因控制的。真核生物染色體DNA的完整性是復(fù)制準(zhǔn)確的前提條件,其損傷和修復(fù)涉及到上百種基因和蛋白質(zhì)參與的調(diào)控[64]。因此,衰老是一個(gè)復(fù)雜的生理生化進(jìn)程。

在植物中,衰老是一個(gè)高度調(diào)控的生理過程,導(dǎo)致器官和組織細(xì)胞死亡,最顯著的表現(xiàn)是葉片衰老[65]。在一年生植物中,葉片衰老與整個(gè)植株的死亡密切相關(guān)。在多年生植物中,葉片的衰老在整個(gè)生命周期中會(huì)發(fā)生很多次,而且在一些壽命較長(zhǎng)的樹木中,分生組織在植物的整個(gè)生命周期中不斷增殖,可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)千年。因此,多年生植物的分生組織細(xì)胞具有強(qiáng)大的端粒DNA修復(fù)和基因組維持機(jī)制[60]。

6 結(jié)語與展望

染色體的末端由端粒DNA重復(fù)序列及其蛋白質(zhì)組成,端粒與染色體末端融合和基因缺失存在著密切關(guān)系,是保持基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素,是生物體生長(zhǎng)發(fā)育和分化的必需因子[66]。端粒酶廣泛存在于真核生物中,維持著生長(zhǎng)發(fā)育過程中端粒長(zhǎng)度的變化,目前在原生動(dòng)物、酵母、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中都能檢測(cè)到其活性。

近年來,針對(duì)端粒、端粒酶及其結(jié)構(gòu)的功能研究相繼被報(bào)道,它們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分裂上的調(diào)控作用逐漸被揭示。端粒的變化和調(diào)控受多種因素影響,包括表觀遺傳、植物激素和DNA甲基化等,其中甲基化是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要方式,對(duì)染色體端粒的完整性起著重要的調(diào)控作用[67～68]。擬南芥中的相關(guān)研究表明,胞嘧啶甲基化對(duì)端粒長(zhǎng)度的維持是至關(guān)重要的,甲基化突變體后代的端粒長(zhǎng)度顯著縮短[69]。盡管在植物中端粒長(zhǎng)度、端粒酶活性的變化及相關(guān)基因的功能研究陸續(xù)被報(bào)道,但是影響植物端粒復(fù)制、端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性的因素還有待進(jìn)一步研究,另外端粒及端粒酶的功能還涉及大量蛋白質(zhì)的參與,對(duì)其功能和調(diào)控的研究將是今后重點(diǎn)方向之一。