孫衛(wèi)國(guó) 曹志紅 李改平 楊秉芬 劉艷華 賀雄 張靈霞

傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法存在較大局限性，如抗酸染色敏感性低，而作為結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)則耗時(shí)較長(zhǎng)，影響了結(jié)核病的早期診斷。結(jié)核病血清學(xué)診斷雖然具有快速特點(diǎn)，但所用的抗原仍然局限于38kD蛋白、16kD蛋白、ESAT-6、CFP-10等少數(shù)幾種，并且單獨(dú)用于結(jié)核病臨床診斷效果較差。另外，很大一部分人群處于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)狀態(tài)，臨床上目前還沒(méi)有成熟的LTBI診斷和檢測(cè)方法。結(jié)核病的防控需要開(kāi)發(fā)新的診斷方法去鑒別并阻止?jié)摲腥净颊甙l(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病(Tuberculosis，TB)[1]，目前以細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的結(jié)核分枝桿菌γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon γ release array,IGRA)已經(jīng)獲得快速發(fā)展并進(jìn)入臨床應(yīng)用。這種檢測(cè)方法目前以T-SPOT，TB和QuantiFEron-TB Gold 試劑盒為代表，能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與BCG接種，適用于我國(guó)BCG廣泛接種的地方[2]。實(shí)驗(yàn)室研究中有諸多 LTBI 相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的報(bào)道，成為L(zhǎng)TBI機(jī)制研究熱點(diǎn)，并有望應(yīng)用于LTBI 的診斷。結(jié)核分枝桿菌Rv2660c和Rv2659c蛋白為BCG RD11區(qū)缺失抗原，是一類LTBI相關(guān)蛋白。體外低氧或營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境下培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)Rv2659c和Rv2660c這兩種蛋白基因的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)[3]；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，在135株M.TB臨床分離株中，Rv2660c未發(fā)現(xiàn)突變，它的基因序列比較保守[4]。Rv2660c蛋白刺激結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)釋放IFN-γ水平明顯高于健康人群對(duì)照組[5]，這些都提示Rv2660c在潛伏感染狀態(tài)下機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)潛伏感染過(guò)程中扮演著重要的角色。

鑒于Rv2660c蛋白在結(jié)核分枝桿菌中的作用和結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)，本課題采用成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組Rv2660c蛋白，以Western-Blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該重組蛋白的抗原性，同時(shí)以ELISA 實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其在血清學(xué)方面用于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病與潛伏感染是否具有診斷價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究該重組Rv2660c蛋白的干擾素-γ釋放試驗(yàn)，分析其在潛伏感染實(shí)驗(yàn)室診斷上的可行性 ；同時(shí)為研究 Rv2660c 在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)的功能和結(jié)核分枝桿菌在饑餓狀態(tài)下免疫逃逸和潛伏感染等分子奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、材料

1 研究對(duì)象 50例確診菌陽(yáng)肺結(jié)核患者血清與50例菌陰肺結(jié)核患者血清由本室臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定收集提供，患者中男性60例，女性40例，年齡22～52歲，平均(35.6±15.2)歲，患者經(jīng)臨床表現(xiàn)、體征、胸部CT及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果確診為肺結(jié)核，且無(wú)同時(shí)患有其它呼吸類疾病；菌陽(yáng)患者為結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，菌陰患者為結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性；30例干擾素-γ 釋放試驗(yàn)陽(yáng)性的健康人(定義為潛伏感染者)血清本室收集保存，患者中男性15例，女性15例，年齡18～60歲，平均(33.2±16.3)歲；30例干擾素-γ 釋放試驗(yàn)陰性的健康人血清由本院體檢中心提供，患者均為男性，年齡18～40歲，平均(23.2±14.6)歲。干擾素-γ 釋放試驗(yàn)采用上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)，具體操作見(jiàn)說(shuō)明書。

2 質(zhì)粒、菌株和血清 質(zhì)粒pET-28a、E.coli DH5a、表達(dá)菌種BL21(DE3)系本室保存，其感受態(tài)細(xì)胞由本室制作。

3 儀器與試劑 Rv2660c蛋白全基因和引物由華大基因公司合成， NdeI(批號(hào)：0290201)與 XhoⅠ(批號(hào)：0581503)、T4 DNA連接酶(批號(hào)：0021012)購(gòu)自NEB公司(美國(guó))；PCR試劑來(lái)自天根生化生物公司(國(guó)產(chǎn))；酶標(biāo)羊抗人IgG購(gòu)自華美生物技術(shù)公司；親和樹脂填料購(gòu)自美國(guó)GE公司，本室裝填純化柱、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量marker (美國(guó)sigma公司)；其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

二、方法

1 Rv2660c 全基因與引物合成 通過(guò)NCBI查Rv2660c 的Gene ID: 887222，全基因共228個(gè)堿基.進(jìn)行全序列合成，在5′ 和3′ 端分別引入NdeI(CATATG)和XhoⅠ( CTCGAG)酶切位點(diǎn) ，在3′ 端加入原核表達(dá)系統(tǒng)偏愛(ài)終止密碼子TAA。合成全序列為：catatggtgatagcgg gcgtcgacca ggcgcttgca gcaacaggcc aggctagcca gcgggcggca ggcgcatctg gtggggtcac cgtcggtgtc ggcgtgggca cggaacagag gaacctttcg gtggttgcac cgagtcagtt cacatttagt tcacgcagcc cagattttgt ggatgaaacc gcaggtcaat cgtggtgcgc gatactggga ttgaaccagt ttcac taactcgag

合成的陽(yáng)性克隆篩選鑒定引物為： 正向引物 5-ccccatatggtgatagcgg -3, 反向引物 5-ccgctcgagttagtgaaactgg-3

2 pET28a - Rv2660c 表達(dá)載體的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對(duì)華大基因公司提供Rv2660全序列陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pUC19- Rv2660c進(jìn)行雙酶切獲得大小約230bp大小的核酸片段，然后與同樣雙酶處理的表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，獲得表達(dá)工程菌 pET28a - Rv2660c。

3 Rv2660c 融合蛋白的原核表達(dá)與純化 將陽(yáng)性工程菌株轉(zhuǎn)接至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)，監(jiān)控細(xì)菌生長(zhǎng)A600 值，當(dāng)OD值為0.5時(shí)加入IPTG至終濃度為0.3mmoL，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)7h，離心收集菌體，在冰浴狀態(tài)下進(jìn)行超聲破碎。4℃條件下高速離心后(12000rpm, 30分鐘)，取上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的表達(dá)形式。重組蛋白N端攜帶6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，通過(guò)鎳離子螯合的親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和純化，分別以50mmoL咪唑除去菌體自身雜蛋白、150 mmoL咪唑洗脫收集重組，以15% SDS-PAGE鑒定純化后蛋白純度。

4 重組Rv2660c蛋白Western-Blot與ELISA實(shí)驗(yàn)分析 將純化的重組Rv2660c蛋白干粉用PBS緩沖液配制成1mg/mL的母液備用，取 2μL加入載樣Buffer煮沸10min后行SDS-PAGE，半干法電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，分別以確診菌陽(yáng)結(jié)核病患者、菌陰結(jié)核患者、潛伏感染者和健康人對(duì)照血清37℃孵育2小時(shí)，PBST緩沖液洗滌后、以HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 37℃孵育1小時(shí)，漂洗干凈，過(guò)ECL暗室自動(dòng)曝光顯影，分析該重組蛋白的抗原性。

以碳酸鈉鹽溶液將純化的重組Rv2660c蛋白進(jìn)行稀釋，終濃度為6μg/mL，往96孔酶標(biāo)板每孔加入100μL重組蛋白包被液，包被過(guò)夜，次日37℃條件下用5%的脫脂奶粉封閉2h，用PBS-Tween(0.05%)洗板5次，將菌陽(yáng)結(jié)核病患者組、菌陰結(jié)核患者組、潛伏感染者組和健康人對(duì)照組血清用PBST按1 ∶20進(jìn)行稀釋，每孔100μL分別加入包被孔和對(duì)照孔，于37℃孵育1h，重新洗板若干次，每孔再加入用 PBST按1 ∶1000 稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG 100μL，37℃震蕩孵育30min，再洗板5次，加TMB色底物，100μL/孔，室溫避光反應(yīng)30min，每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)450m波長(zhǎng)處的A值,分析結(jié)果。

5 統(tǒng)計(jì)方法 用健康人的平均OD值加上2.576倍的其標(biāo)準(zhǔn)差(SD)作為cutoff( 即cutoff=meanhealthy+2.576×SD)來(lái)計(jì)算重組Rv2660c蛋白的檢出率和特異性[6]。

結(jié) 果

一、pET-28a-Rv2660c表達(dá)載體構(gòu)建

將合成的 Rv2660c 核酸序列通過(guò)分子克隆技術(shù)插入到 pET-28a 表達(dá)載體上，采用菌落PCR的方法進(jìn)行鑒定，1%的瓊脂糖核酸電泳顯示擴(kuò)增片段大小在230bp左右，與預(yù)期值相符(圖1)。將陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)構(gòu)建成功。

圖1 Rv2660c核酸PCR鑒定凝膠電泳鑒定結(jié)果

M.marker DNA2000 1，3，5.重組Rv2660c陽(yáng)性克隆；2，4.重組Rv2660c陽(yáng)性克隆

二、重組Rv2660c融合蛋白表達(dá)與純化

重組Rv2660c工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可獲得目的蛋白的原核表達(dá)，經(jīng)過(guò)冰浴超聲破碎后，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，在目的分子量10.2KD處有明顯的蛋白表達(dá)，箭頭所示，其中超聲破碎上清和沉淀各占50%左右(圖2)。

圖2 重組Rv2660c蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析

M.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 1.無(wú)誘導(dǎo)對(duì)照 2.超聲后上清 3.超聲后沉淀

表達(dá)上清以親和層析純化后，150mmol咪唑洗脫液獲得的純化蛋白純度在85%左右(圖3)。

圖3 重組Rv2660c蛋白親和純化SDS-PAGE分析

M.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 1.低濃度咪唑洗脫的雜蛋白； 2.親和純化的重組Rv2660c蛋白

三、重組Rv2660c蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將菌陽(yáng)結(jié)核病患者、菌陰結(jié)核病患者、潛伏感染者以及健康對(duì)照者的血清分別與重組蛋白進(jìn)行印記實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖4)?；顒?dòng)性結(jié)核患者(包括菌陽(yáng)患者和菌陰患者)的血清抗體能與獲得的重組蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)一條明顯的雜交條帶；而潛伏感染者和健康對(duì)照者的血清沒(méi)有出現(xiàn)雜交條帶。表明活動(dòng)性結(jié)核患者體內(nèi)存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體，潛伏感染者和健康對(duì)照者體內(nèi)不存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體或抗體的滴度很低。

圖4 重組Rv2660c蛋白與各類血清Western Blot結(jié)果

四、重組Rv2660c蛋白ELISA試驗(yàn)結(jié)果

以重組純化獲得的 Rv2660c 蛋白為包被抗原，應(yīng)用 ELISA方法檢測(cè)各組人群血清中Rv2660c特異性抗體水平。結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1 ELISA檢測(cè)各組人群血清中 Rv2660c 特異性抗體結(jié)果組間比較

經(jīng)Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，四組P分別等于0.714、0.407、0.660、0.848，認(rèn)為所有四組數(shù)據(jù)均為近似正態(tài)分布。然后進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)，P值等于0.141，認(rèn)為方差具有齊性。四組均數(shù)比較F=374.209，P=0.0，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后對(duì)組間均數(shù)進(jìn)行兩兩比較，每?jī)山M之間P值均<0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

重組蛋白與活動(dòng)性結(jié)核病患者血清無(wú)論是菌陽(yáng)性還是菌陰性均發(fā)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，二者無(wú)顯著區(qū)別，P>0.05；它們的A450吸光值明顯高于潛伏感染組或健康對(duì)照組(P<0.05)；而潛伏感染組與健康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，設(shè)置cutoff為 meanhealthy+2.576×SD，重組蛋白檢測(cè)結(jié)核病人的陽(yáng)性檢出率為61%，特異性為95.3%，檢測(cè)潛伏感染者血清的敏感性為21.6%，特異性為95.3%。結(jié)果證實(shí)重組Rv2660c蛋白對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷具有較強(qiáng)的特異性，用于活動(dòng)性結(jié)核病血清學(xué)診斷有一定價(jià)值，但相對(duì)于潛伏感染患者血清學(xué)診斷而言，不具有診斷作用。

討 論

尋找特異性血清學(xué)診斷抗原或者融合肽曾經(jīng)是結(jié)核病臨床診斷挖掘的方向，但目前敏感抗原還局限于38kD、ESAT-6、CFP-10等少數(shù)幾種，雖然它們的特異性都能滿足臨床需求，但敏感性較低，無(wú)法進(jìn)行廣泛的應(yīng)用。新型的干擾素-γ釋放試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染，目前這種方法已經(jīng)用于結(jié)核病患者的臨床診斷，同時(shí)，這種干擾素-γ釋放試驗(yàn)也開(kāi)始用于LTBI的輔助診斷[7]，目前用于干擾素-γ釋放試驗(yàn)結(jié)果較好的仍然是結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼特異性抗原ESAT-6和CFP-10，它們可以區(qū)分BCG接種和結(jié)核分枝桿菌感染，與結(jié)核菌素試驗(yàn)相比有更高的靈敏度和特異度[8]。結(jié)核病的臨床診斷需要新型結(jié)核分枝桿菌特異性抗原去提高診斷的敏感性，也需要新的特異蛋白鑒別活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染。隨著研究的深入，一部分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)、功能和潛伏感染相關(guān)性被逐漸認(rèn)知，實(shí)驗(yàn)室有望利用結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)抗原的功能作用建立起篩選結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷方法。Voskuil等[9]通過(guò)在體外缺氧的環(huán)境下培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中50個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)，這些基因涉及到細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、代謝和無(wú)氧呼吸等，它們被認(rèn)為與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染有關(guān)。

結(jié)核分枝桿菌Rv2660c也是一種潛伏感染相關(guān)蛋白，與結(jié)核分枝桿菌營(yíng)養(yǎng)代謝有關(guān)，是饑餓刺激(Starvation stimulon)相關(guān)蛋白，環(huán)境營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)其表達(dá)上調(diào)，理論上可用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷研究。通過(guò)生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Rv2660c與人類蛋白的同源性僅為16%，和BCG菌體蛋白重復(fù)序列也較少，氨基酸序列保守，具有豐富的T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位，抗原預(yù)測(cè)分值為0.9073，適合作為抗原進(jìn)行疫苗研發(fā)或者診斷研究[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核重組的方法獲得Rv2660c蛋白，分別將菌陽(yáng)結(jié)核病患者、菌陰結(jié)核病患者、潛伏感染者以及健康對(duì)照者的血清分別與重組蛋白進(jìn)行印記實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活動(dòng)性結(jié)核病患者(包括菌陽(yáng)患者和菌陰患者)的血清抗體能與獲得的重組蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)一條明顯的雜交條帶；而潛伏感染者和健康對(duì)照者的血清沒(méi)有出現(xiàn)雜交條帶。說(shuō)明活動(dòng)性結(jié)核患者體內(nèi)存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體，潛伏感染者和健康對(duì)照者體內(nèi)不存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體或抗體的滴度很低。同時(shí)血清ELISA實(shí)驗(yàn)表明菌陽(yáng)結(jié)核病患者組、菌陰結(jié)核病患者組、潛伏感染組以及健康對(duì)照組A450平均值分別為0.52±0.21、0.48±0.16、0.28±0.14 和0.25±0.17。重組蛋白檢測(cè)結(jié)核病人血清的陽(yáng)性檢出率為61%，特異性為95.3%；檢測(cè)潛伏感染者血清的陽(yáng)性檢出率為21.6%，特異性為95.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組Rv2660c蛋白對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核的診斷具有較強(qiáng)的靈敏度和特異性，但對(duì)潛伏感染的診斷沒(méi)有價(jià)值。也說(shuō)明單獨(dú)某一結(jié)核分枝桿菌重組抗原雖然具有良好的免疫反應(yīng)性，但在血清學(xué)診斷應(yīng)用上很難達(dá)到滿意的結(jié)果，同時(shí)，相對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏感染狀態(tài)，通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分也幾無(wú)可能。推測(cè)Rv2660c蛋白可能只在結(jié)核分枝桿菌活動(dòng)或特定的環(huán)境下(比如結(jié)核分枝桿菌饑餓狀態(tài)下)通過(guò)上調(diào)表達(dá)抑制菌體某些代謝相關(guān)基因的功能，激發(fā)宿主提高體液免疫應(yīng)答，而在潛伏感染穩(wěn)定的狀態(tài)下，結(jié)核分枝桿菌處于休眠不復(fù)制的平衡狀態(tài)，Rv2660c蛋白不再表達(dá)，而結(jié)核分枝桿菌休眠前Rv2660c蛋白在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體逐漸被稀釋或降解。機(jī)體免疫有記憶性，用重組Rv2660c蛋白刺激潛伏感染者的淋巴細(xì)胞，理論上會(huì)釋放干擾素-γ。實(shí)驗(yàn)后期將以重組Rv2660c蛋白開(kāi)展干擾素-γ釋放試驗(yàn)，分析其在潛伏感染實(shí)驗(yàn)室診斷上的可行性，同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌在饑餓狀態(tài)下免疫逃逸和潛伏感染相關(guān)機(jī)制研究。