方紅

肺癌(lung cancer)根據(jù)病理類型分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占全部肺癌患者的80%左右[1-2]。新近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，肺癌在男性發(fā)病率和死亡率均占到了第一位，在女性死亡率占到第一位而發(fā)病率僅次于乳腺癌占第二位[3]。肺癌患者預(yù)后不良，容易早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。然而肺癌的確切發(fā)病機制仍不十分清楚，目前的研究結(jié)果認為其發(fā)病與吸煙、環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基因表達譜芯片及二代測序技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模、高通量在基因分子水平上探討肺癌發(fā)病機制成為可能[4]。同時也為肺癌的治療提供了新的方向[5]。在本研究中，我們采用生物技術(shù)方法探討細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A在NSCLC中的差異表達、可能生物學(xué)功能及與患者的預(yù)后關(guān)系。

資料與方法

一、相關(guān)數(shù)據(jù)庫選擇

選擇癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA)比較NSCLC患者癌組織、正常肺組織的差異表達水平及其與患者預(yù)后關(guān)系；采用蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫STRING進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。David數(shù)據(jù)庫進行功能富集和KEGG信號通路分析。

二、CDKN2A差異表達、功能富集和信號通路分析

TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索“非小細胞肺癌”和“CDKN2A基因”檢索物種為人類，分析比較CDKN2A基因表達水平在NSCLC患者癌組織和正常肺組織中是否存在差異。同時分析了TRIM26基因在多種人體腫瘤中的表達水平，存在差異的條件為基因|Log2FC|>1，P<0.05。CDKN2A基因及相互作用蛋白進行功能富集和信號通路分析。功能包括，細胞定位、分子功能和生物學(xué)過程。

三、 蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CDKN2A基因編碼蛋白進行相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，STRING (http://string-db.org/cgi/input.pl)[6]，相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.7。

四、預(yù)后分析

CDKN2A基因高低表達按NSCLC患者腫瘤組織中位數(shù)進行劃分，并繪制高低表達組Kaplan-Meier生存曲線進行l(wèi)og-rank檢驗，對比總生存和無疾病進展生存有無差異。

五、免疫組化檢測CDKN2A表達

回顧性分析我院近5年收治并手術(shù)治療的非小細胞肺癌(NSCLC)患者62例為研究對象。62例患者中男性41例，女性21例，平均年齡68.8±11.2歲，其中腺癌34例，鱗癌28例。采用免疫組化SP法檢測患者腫瘤組織和對應(yīng)的癌旁組織中CDKN2A的表達水平。比較癌組織和癌旁組織中CDKN2A表達水平是否存在差異。同時采用log-ran檢驗比較CDKN2A陽性和陰性表達組患者生存期是否存在差異。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

相關(guān)聚類、差異表達、蛋白網(wǎng)路等采用在線軟件分析，生存數(shù)據(jù)采用log-rank檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

一、CDKN2A在非小細胞肺癌中的表達

CDKN2A基因在多種實體腫瘤包括乳腺癌、食管癌、腸癌等中表達水平明顯上調(diào)(圖1A)。在NSCLC患者(包括腺癌和鱗癌)癌組織中CDKN2A表達水平均明顯高于對應(yīng)的正常肺組織(pall<0.05)，圖1B。而CDKN2A表達水平與腫瘤分期無明顯相關(guān)性，P>0.05(圖1C)。

圖1 細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2a(CDKN2A)在腫瘤組織與正常組織中的表達比較

A: CDKN2A在多種腫瘤中的表達比較，紅色為腫瘤組織，藍色為癌旁組織； B:NSCLC患者(包括鱗癌和腺癌)癌組織與對應(yīng)的癌旁組織中CDKN2A表達比較，紅色為腫瘤組織，綠色為癌旁組織；C: CDKN2A與NSCLC患者分期關(guān)系

二、CDKN2A相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CDKN2A相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中(圖2)，蛋白之間的相互作用關(guān)系指數(shù)為24.8，區(qū)域聚類指數(shù)為0.74，相互作用蛋白呈現(xiàn)明顯的聚類表達，P<0.05(見圖3)。

圖2 CDKN2A相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 CDKN2A相關(guān)蛋白聚類分析熱圖

三、GO和KEGG功能富集和信號通路分析

CDKN2A編碼蛋白主要定位在細胞核、細胞膜和囊泡，分子功能主要為蛋白結(jié)合、核蛋白結(jié)合和鐵結(jié)合。而生物學(xué)過程主要集中于代謝、細胞增殖及對刺激的反應(yīng)(圖4)。KEGG信號通路主要為細胞周期調(diào)控、DNA蛋白結(jié)合以及Wnt信號通路。

圖4 CDKN2A基因功能富集

四、 生存分析

CDKN2A高表達NSCLC患者總生存期明顯低于低表達組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=1.3,P=0.02)，而CDKN2A高低表達組間，NSCLC患者無疾病進展生存無統(tǒng)計學(xué)差異(HR=0.94,P=0.59)(圖5)。

圖5 CDKN2A高低表達組與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系的生存曲線(A:NSCLC患者總生存比較；B:NSCLC患者無疾進展生存比較)

五、免疫組化CDKN2A表達及其與患者預(yù)后

62例NSCLC患者癌組織中CDKN2A陽性表達11例(17.7)而對應(yīng)癌旁組織中陽性表達49例(79.0%)，癌組織中CDKN2A陽性標的率顯著高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而CDKN2A陽性組與陰性組患者生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(HR=0.99,P>0.05)(圖6)。

圖6 CDKN2A陽性組與陰性組患者生存曲線

討 論

細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A(CDKN2A)或P16INK4A，在人類定位于9號染色體，21區(qū)[7-8]。該基因全場8500bp，包括3個外顯子，編碼一個由148個氨基酸組成的蛋白。該基因首先在上世紀90年代初由Serrano發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究中認為其可與CDK4、CDK6結(jié)合，抑制周期素與CDK4形成具激酶活性的復(fù)合物，從而阻斷該復(fù)合物對RB蛋白磷酸化，導(dǎo)致細胞停止于G，從而抑制了細胞的增殖，是一個細胞周期依賴的蛋白。1994年(美國冷泉港實室)新發(fā)現(xiàn)CDKN2A是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調(diào)控，負有調(diào)節(jié)細胞增殖及分裂，在人類50%腫瘤細胞株中發(fā)現(xiàn)有純合子缺失，認為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因有人把它比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導(dǎo)致細胞惡性增殖，導(dǎo)致惡性腫瘤。

后續(xù)研究逐漸發(fā)現(xiàn)，CNKN2A基因在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)差異表達，在腫瘤患者癌組織中表達水平往往上調(diào)，并與患者的臨床病理特征和預(yù)后存在一定的相關(guān)性。如楊軍[9]等人研究發(fā)現(xiàn)CDKN2A在膀胱癌患者癌組織中異常表達并膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。王勇文等人[10]研究顯示CDKN2A基因的變異及其編碼蛋白質(zhì)的失活與小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。而CDKN2A在非小細胞肺癌(NSCLC)中的研究及其功能相對報道較少，CDKN2A高低表達與NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系也并不明確。因此。我們采用生物技術(shù)方法探討細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A在NSCLC中的差異表達、可能生物學(xué)功能及與患者的預(yù)后關(guān)系，以期待為臨床治療NSCLC提供新的思路和靶向藥物研發(fā)方向。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CDKN2A基因在多種實體腫瘤包括乳腺癌、食管癌、腸癌等中表達水平明顯上調(diào)。CDKN2A的常高表達可能與多種人體腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括NSCLC。而CDKN2A相關(guān)的信號通路也大多集中于細胞周期分裂和細胞增殖，再次證明CDKN2A參與了細胞的周期調(diào)控，可能成為抑制腫瘤分裂癥狀的重要靶點。同時我們研究證明，CDKN2A的高表達與NSCLC患者的預(yù)后不良有關(guān)，有望成為NSCLC預(yù)后的分子標志物。但研究僅從生物信息層面進行了證實，后續(xù)仍需要相關(guān)分子生物學(xué)實驗進行驗證。